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(無題) 削除/引用 No.4268-17 - 2007/05/30 (水) 13:55:12 - gene 誤）indea ink 正）india ink

(無題) 削除/引用 No.4268-16 - 2007/05/30 (水) 13:44:40 - gene ちなみに、indea inkって墨汁のことですわ。 Molecular Cloning 2nd ed.にでているタンパクブロットをindea inkで染色するプロトコールでは、このブランドが特におすすめだというのが2つくらいあがっていましたが（いずれも日本ではなじみがない）、お習字用の墨汁でもいけます。 要は、カーボンコロイド（スス）がタンパク質に吸着する性質を利用しています。

なぜ？ 削除/引用 No.4268-15 - 2007/05/30 (水) 13:20:30 - かめ ＞名無しさん 同感です。stripしたけれど、一度目に検出したバンドもやはり濃かったです（一回しかやってないけど）。 インディアインクなんて、いろいろ知らないことが出てきて面白いんですけど、皆さんどうしてtransfer直後に染めたいと思われるのか、目的を教えてもらえないでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.4268-14 - 2007/05/30 (水) 08:22:21 - 名無し ウエスタンしてCBBで膜染める事ある。けっこうきれいに染まる。ただ最近気になるのは、（全部という訳ではないけど）抗体と強く反応したバンドは、CBBで染めたとき（抗体反応しなかった膜とかゲルとかと比べて）濃く見えるような気がする。くっついてる抗体の分もCBBで染まってるのかなあ、とか考えたけどよく分からない。でも本来のその蛋白質量より多く見積もってしまうとちょっとよくないかなあ、とかもこのごろ少し思う。

メンブレンのタンパクを染める方法 削除/引用 No.4268-13 - 2007/05/25 (金) 21:34:17 - ウエスタン 答えその1 ＜メンブレンはPVDFですか、それともニトロセルロースですか? PVDFメンブレンです。 答えその2 ＜検出方法 ECLアドバンスです。 検出になんら影響はありません。ただ、抗体との反応や洗浄による振盪操作によって少しずつですが薄くなります。以前はトランスファー後のゲルをBPB染色してバンドの確認をしていましたが、その手間がなくなりました。これはアメリカに留学していた上司が覚えてきたテクニックだそうです。

(無題) 削除/引用 No.4268-12 - 2007/05/25 (金) 14:42:53 - 通りすがり インディアインクは自分も前から興味があり、調べてたのですが Chemiluminescentによる検出にCompatibleだという話と Backgorundが残りChemiluminescentでは検出不可能になるので RIなどによる検出でのみ使うべきだという 二つの意見を耳にしているのですが ウェスタンさんは検出法はどのようにしていらっしゃるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4268-11 - 2007/05/25 (金) 12:50:49 - おお >[Re:10] ウェスタンさんは書きました : > トランスファーした後、0.3％Tween20/PBSで一度振盪洗浄して、もう一度同じバッファーにつけてから、インディアインク（製図用黒インクだそうですが）を50〜100μｌ加えて、10分間くらい振盪すると、蛋白のバンドがはっきり出ます。 ありがとうございます。メンブレンはPVDFですか、それともニトロセルロースですか?インディアインク確かに聞いたことあります。でも最近しらべたプロトコールには出てこなかったので存在を忘れてました。

メンブレンのタンパクを染める方法 削除/引用 No.4268-10 - 2007/05/25 (金) 12:25:46 - ウェスタン トランスファーした後、0.3％Tween20/PBSで一度振盪洗浄して、もう一度同じバッファーにつけてから、インディアインク（製図用黒インクだそうですが）を50〜100μｌ加えて、10分間くらい振盪すると、蛋白のバンドがはっきり出ます。もう一度同じバッファーで洗ってから、ブロッキングをして、ウエスタンブロットを行っています。 そのままブロッティングを行っていますが、今のところ支障はありません。

(無題) 削除/引用 No.4268-9 - 2007/05/25 (金) 11:31:41 - K トピックの趣旨とは大いにズレますが、 Zincステイン(ネガティブステイン)(リバースステイン？)のときの画像の取り込みは、 染色後ゲルをよく純水になじませた後、 スキャナーにOHPシートを敷き、ゲルを置き、さらにOHPシートを敷いてスキャンすると、 電気機器に優しいですよ。 OHPシートにはなにやらノリのようなものが塗ってあることがあるので、 よく水で拭いてから、使うことをお勧めします。 でないと、ゲルがシートでパックされてしまうんです。 一度これをやって悲惨なことになりました…

(無題) 削除/引用 No.4268-8 - 2007/05/25 (金) 05:40:23 - おお 皆さんありがとうございます。 Amidoblackハニトリセルロースでも一瞬で染色すると行けるようですね。どなたかニトリセルロースように工夫したプロトコールをお持ちでしょうか。 リバースステインも良いかもしれませんね。この場合データーとして画像を残すのは少し工夫が入ると聞いたような気がします

(無題) 削除/引用 No.4268-7 - 2007/05/24 (木) 18:38:33 - カナマイシン 目的からずれる可能性がありますが、 ゲルの段階で逆染色（リバースステイン／鉛染色）で染めるのはいかがでしょうか？ 感度がCBBよりも上というくらい高いですし、脱色後に 膜転写も可能ですし。

(無題) 削除/引用 No.4268-6 - 2007/05/24 (木) 15:32:22 - 通りすがり 自分もPonceau SかCBBしかやったことないですが 下記のサイトの下(Total Protein Blot Stains)のほうに ６種類(CBB, Ponceau, amidobclak,CPTS, transillumination, SYPRO ruby) でミリポアのPVDFでのタンパクを染めてる例が載ってます。 http://www.millipore.com/publications.nsf/docs/asbm2004 求めてるのが感度かどうかしりませんが SYPRO RUBYが一番高そうですね。でも極端には変わらないようです。 SYPRO rubyは使ったことないから脱色して ウエスタンできるのかどうか知りませんが Amidoblackはたしかニトロセルロースでは そのまま脱色してウエスタンできたはずです。 あとCPTSは全く知らんかったやり方です。

(無題) 削除/引用 No.4268-4 - 2007/05/24 (木) 15:22:41 - へろ 知っているけれど貧乏なので使ったことが無いのがsypro ruby protein blot stainです。 http://www.funakoshi.co.jp/catalog/proteomics/pdf/proteomics_47.pdf ウェスタンの前に使いたいなと思っていました。もし使ってみたことがある方がいれば、私も感想を聞いてみたいです。

(無題) 削除/引用 No.4268-3 - 2007/05/24 (木) 15:11:32 - CBB PVDFメンブレンならCBB染色できますよ。きれいに脱染もできます。

メンブレンのタンパクを染める方法 削除/引用 No.4268-1 - 2007/05/24 (木) 14:39:44 - おお 皆様の使っている、ウエスタンでメンブレンにトランスファーした直後にメンブレンのタンパクを染める方法を教えてください。その後そめたメンブレンをウエスタンで検出します。なぜそうしているかとか、うんちく大歓迎です。 私はPonceau S使っていますが、色が薄いので強いのがいいなと思って選択肢を探っています。

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