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:-) 削除/引用 No.4263-15 - 2007/05/31 (木) 23:57:58 - わからないことばかり ringringさん！ ありがとうございます！ 確かに、一次抗体に二次抗体（これがCy3とで） をくっつけていますが、ABC法ではないです。 シグナルは抗体の濃度によってはハッキリします。 問題なのはポジテゥブのコントロールで、 もっと強そうな（酵素に対して）Modulatorを ほかの論文で見つけたので、 これも担当教官（来週休暇から戻ってくるので） に相談してみようと思ってます。 やはり、この方法は目で見て説得力が無いなぁと・・・。 またよろしくお願いします！

ABC法 削除/引用 No.4263-14 - 2007/05/30 (水) 07:00:42 - ringring もしかして、担当教官の先生方は、蛍光以外でやるとするとABC法を考えたのかもしれません。キットを使うと高いし、個別に買うとしてもアビジンとかいろいろ必要になるからかも・・・ 実は私はABC法のキットを使って増感させていました。ただ、蛍光の画像よりもDABの方が濃淡がはっきりするかな？と思ったので・・・ でもアビジンをつかわなければもしかするとシグナルは蛍光のほうが強いのかもしれません。 いずれにせよ、ZVIできちんと解析できるといいですね。 がんばってください。

Re蛍光標識をHRP標識に 削除/引用 No.4263-13 - 2007/05/30 (水) 00:39:05 - わからないことばかり ringringさん HRP標識やDABについて少し勉強してから （この知識は乏しいので・・・） 担当教官に相談してみようと思います。 ただ、ImageJにZVI-ReaderをPluginしたものを インストールすることができたので、 そちらで解析することも可能か検討する予定です。 HRP標識についてわからないことがあったら またアドバイスお願いします！

蛍光標識をHRP標識に 削除/引用 No.4263-12 - 2007/05/29 (火) 20:39:12 - ringring ・・・と思ったのですが。。。 どのように蛍光染色しているかにもよりますが、文面から想像してとある酵素に対する一次抗体をつけてさらにCy3がくっついている二次抗体で染色しているのかなぁ？と思いました。それならば二次抗体をHRP標識に変えてDABで発色させれば蛍光ではなく普通の顕微鏡で（もしかして蛍光顕微鏡しかないのでしょうか？）画像を取り解析すると、濃淡はっきりするとおもいます。DAB発色は茶色なので反応が強ければ肉眼でもわかります。 もし、最初からCy3がくっついている一次抗体をお使いなら無理ですが、二次抗体を変えるのと（一次抗体にくらべればコストは安いと思います。特殊じゃない限り）DABで発色する工程が入るだけで、基本的な動作は同じだと思います。時間はかからないと思いますけど・・・ 部品がかかるというのはもしかして普通の顕微鏡に変えるとか？ 私は組織しかやったことがないのでそのあたりのことはわかりません。。。蛍光で染色するときは目的は発表のための写真とかでインパクト重視なので定量には使わないので。。。

ありがとうございます！ｒｉｎｇｒｉｎｇさんへ。。。 削除/引用 No.4263-11 - 2007/05/28 (月) 21:07:47 - わからないことばかり ありがとうございます！ 蛍光染色以外でも提案したのですが、 （細かいことはあまり聞けなかったのですが） 他の方法だと足りない部品が多いとかでで・・・ 担当教官や指導ドクターさん達は乗り気になってくれませんでした。 私自身はやる気十分なのですが、 指導者としては、「期限の６ヶ月間を出来るだけ守って欲しい」 ということで、色々試すことにいい顔されないのが 残念ながら現状です。。。 ちなみに、ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅをダウンロードしてみました。 このソフトは開けるフォーマットは限られているのでしょうか？ 今、私の実験結果となる写真のフォーマット（ｚｖｉ．）は、 他のフォーマットに変えてしまうと、 結果と成る蛍光色がかなり弱く見えてしまうのです。 その点でも、何かアドバイスいただけたら嬉しいです。 よろしくお願いします！

ありがとうございます！さいぼうさんへ。。。 削除/引用 No.4263-10 - 2007/05/28 (月) 20:59:27 - わからないことばかり お返事ありがとうございます！ 先週末、とにかく思いついた分析方法を幾つか試したので、 また教官と話せるときに、皆さんや自分の提案について 話してみたいと思います。 今週もう少し勉強しなおして、 また、週末に結果が出てから、困ったことがあったら アドバイスいただければ嬉しいです！ 頑張ります！

ありがとうございます！ＹＴさんへ。。。 削除/引用 No.4263-9 - 2007/05/28 (月) 20:55:10 - わからないことばかり お返事ありがとうございます！ 私の使用している顕微鏡は、 残念ながらコンフォーカルではないと思います。 ＦＡＣＳについて、今週少し自分で勉強してから 担当教官に聞いてみたいと思います。 確かに、ポジティブとネガティブの差を見分けにくいと言うのが現状です。 ポジテルイブのコントロールとしては あるサイトカインを使用するように言われていますが、 これがどうも、ＵＶよりも蛋白発現が弱いような気がします （代わりとなるサイトカインが無いか、調べているところです）。 週末に担当教官と話したところ、 「顕微鏡下で、蛍光色の濃く出た細胞数で頻度を比べたらどうか」 とアドバイス受けました。 ただ、「肉眼での濃さの違いの定義」は曖昧な気がして、 また、差が僅かな為、写真で見分けられない可能性を懸念しています。 今週の実験（または、相談）結果をもう一度見直してから、 またアドバイスをいただければ嬉しいです・・・。

蛍光でないとダメですか？ 削除/引用 No.4263-8 - 2007/05/27 (日) 10:59:35 - ringring 私は組織切片でですが、DAB染色し、scion image（フリーソフト）で解析したことがあります。 私の場合はウェスタンでもある程度差が見られていたので、免染でも同じような結果が得られて、裏づけとすることができました。

(無題) 削除/引用 No.4263-7 - 2007/05/27 (日) 09:12:01 - さいぼう なるほど。既にmRNAに関しても他の方が解析を行う予定なのですね。 ということは、おそらく刺激によって、細胞内局在の変化などがあるかどうかを免疫染色により明らかにすることが主として求められているのではないでしょうか？ 発現量自体の変化はYTさんの言うように、もし蛍光シグナルの強度として目視的にはっきりわかるのであれば卒論のfigureとして示し、定量的でなくてもRT-PCRの結果の裏付けとして卒論の結果の中に記載できると思います。逆に、シグナル強度変化が微妙だったとしても免染なので、発現変化がないとはいえないと思います。 ウエスタンで解析困難というのは、バンドのシグナル強度の差が明確ではないという解釈でよろしいのでしょうか？ 卒研とはなつかしいですね。私の居たところは特に卒業論文みたいなのはなくて、毎週やっていたLab meetingでそれまでは１年間発表を免除されていた４回生が発表するというものだけだったので、まだましでした。 たしかに実験期間が短いので大変ですよね。がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.4263-6 - 2007/05/26 (土) 19:27:37 - YT さいぼう氏の言うように、蛋白の発現量が刺激前後でかなり違わない限り肉眼で観察してかつ変化を説得力のある形で証明するのは蛍光顕微鏡（ｺﾝﾌｫｰｶﾙではないのでしょうか？）のみでは難しい気がします。 　 刺激前に発現が０か無視できる程度で刺激後にﾊｯｷﾘと認められるようになるというのであれば、蛍光顕微鏡での前後の写真を提示すればよいと思いますが、それ程の差では無いからウェスタンでも検出できないのではないでしょうか？　 　 一つ思いつく客観的な方法は、蛍光強度がある程度あるならばFACSで刺激前後で比べることですかね。 ま、いずれにしても、一度「確実にこの酵素をup-regulateする」ような既知の方法があったらポジコンがてら試しにどの位変化するか手持ちの顕微鏡で観察してみはどうでしょうか？　曖昧なものしか見てないとどの位の変化を「有意な変化」として良いのかideaが掴めないでしょうから。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.4263-5 - 2007/05/26 (土) 17:52:04 - わからないことばかり さいぼうさん！お返事ありがとうございます！ >文章から察するに酵素タンパク質自身の発現量変化を調べるということでいいの >でしょうか？ >それでしたら、RT-PCR等でmRNAの量を比較する方が適しているように感じます。 はい。仰るとおりです！ 実は、同じ研究室の人が、卒研としてRT-PCR等でmRNAの量を測定する予定です。 私の課題は、「免疫細胞化学のみ」というのが苦しいところです （卒研の期限が６ヶ月と決まっているので、その間に両方というのは難しいらしいです）。 ソフトの購入となると、研究資金が苦しいらしいです （私以外に蛍光顕微鏡を用いる人が現在居ないのが現状なので）。 やはり、他の大学に出張するというのが一番なのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.4263-4 - 2007/05/26 (土) 01:09:18 - さいぼう 文章から察するに酵素タンパク質自身の発現量変化を調べるということでいいのでしょうか？ それでしたら、RT-PCR等でmRNAの量を比較する方が適しているように感じます。 免疫染色のシグナルで発現量を定量するのは難しいように思います。画像解析ソフトや顕微鏡もそれなりのもの(コンフォーカルなど)がいるようなイメージを持っています（実際のところは詳しくなくて申し訳ありません）。 ただ、もしこの酵素がmRNA量の変化ではなく、翻訳の活性化のみで発現量を変えるようなことだとRT-PCRでも変化を捉えるのは難しいのかもしれませんが。。 もちろん細胞内の発現分布を見るのには免疫染色でいいと思います。

よろしくお願いします！ 削除/引用 No.4263-3 - 2007/05/26 (土) 00:47:34 - わからないことばかり YTさん！ お返事ありがとうございます！ 目的蛋白質は炎症反応の際に活発に生合成される酵素です。 ある細胞をＵＶ（Ａ＆Ｂ）、サイトカイン、またはビタミンで取り扱った結果 （場合によってはビタミン投与とＵＶをコンビにしてます）、 酵素淡白の生合成量がどのように変化するか調べるというのが私の課題です。 今のところ、結果と成る顕微鏡下（または写真内）で、 Ｃｙ３の広がりや濃さをチェックして、 それぞれのＴｒｅａｔｍｅｎｔ間で比べています。 ちなみに、細胞は直径１３ｍｍのカバーガラスの上で Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養したものを染色しています。 マダマダ曖昧ですが、これでもお返事いただけたら嬉しいです。。。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4263-2 - 2007/05/25 (金) 14:53:52 - YT ﾚｽがつかないのは、記述があまりに漠然としてるので皆さん返答のしようがないのだと思います。 　 目的蛋白のどういう性質を調べようとしてるのか、例えば、単に染まって存在が確認できれば良いのか？ある条件下での発現量の変化なのか？局在の変化なのか？　 「分析方法」と言っても、どういうことを分析するのかで全く違います。 　 支障の無い範囲でもう少し詳しくかかれてはどうでしょうか？

免疫細胞化学 削除/引用 No.4263-1 - 2007/05/23 (水) 21:21:33 - わからないことばかり ある酵素たんぱく質を 免疫細胞化学で蛍光染色（Cy3とDAPI使用) するというテーマで卒研してます。 Westernblottではどうしてかウマクいかないため （担当Doktorさんが何度も試した結果）、 うちの研究室では免疫細胞化学を使うという結論に至りました。 困ったのが結果分析です。 担当教官には、「自分の目で分析するように」と指導されていますが、 これがナカナカ・・・ その日によって自分の見方も変わるような気がしてなりません。 また、大学設置の蛍光顕微鏡には適当なソフトがありません （カメラもソフトも古いもので・・・）。 アナログで、しかも適当な分析方法は無いものかと思案しています。 皆さん、何かアドバイスがあったらお願いします。

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