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(無題) 削除/引用 No.4258-8 - 2007/05/24 (木) 09:11:14 - バキュロ 皆さま、親身な回答本当に有難うございます。 細胞をたたいて剥がす際、ガンガンたたいても大丈夫なのですね。 以前はフラスコを使って培養していましたが、セルスクレーパーを使うようになってからはシャーレで培養しています。 早速フラスコでの培養とシントウ培養についても検討したいと思います。 「付着性の強い細胞は感染か発現が弱い」 これはは知りませんでした。という事だと今まで培養してきたなかなか剥がれない付着性が強めの細胞は、感染か発現が弱いかも知れないということですよね。元気な細胞は強く付着してると思い込んでいましたが･･･

(無題) 削除/引用 No.4258-7 - 2007/05/23 (水) 23:31:11 - 純ココア セルスクレーパーは止めたほうがいいです。 結構死にます。細胞を回収するときだけにするべきです。 叩いても剥がれないようですが、おそらく叩き方があまいと思います。 シャーレですか？フラスコですか？ フラスコなら手の平の手首に近い部分でかなり強めにガンガン叩いています。培養日数（細胞密度）にも拠りますが、ほとんど剥がれてきます。 シャーレは継代には使わず、発現用に大量に培養する必要があるときだけ使っています。とはいってもときにはここから継代することもあります。この場合はピペッティングではがしています。5ｍLや10ｍLのピペットで勢いよく吹き付ければ剥がれます。 みなさんがおっしゃるように振とう培養も一案です。 大腸菌増やせるならできるはずですが。 発現実験に細胞の状態は非常に重要なファクターだと思います。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.4258-6 - 2007/05/23 (水) 20:50:25 - a 昔、sf9を使ったとき、真偽のほどは不明ですが、付着性の強い細胞は、感染か発現が弱いと聞いていました。PBS-ですすいで、電話帳程度の本にフラスコの側面を（壊れない程度に）叩きつけて剥がれる細胞を継代していました。数代経つと付着性の適当に弱い細胞群になりました。わたしが使っていた培地は、TC100+トリプトースホスフェートブロス+10% FCS at 20degCでした。たんぱく質発現の良否は保証の限りではありません。

(無題) 削除/引用 No.4258-5 - 2007/05/23 (水) 17:30:45 - ヨトウガ 依然同様の問題を抱えていた際、哺乳細胞と同様にトリプシン／ＥＤＴＡもしくはＥＤＴＡのみでsf9を剥がしてました。剥がした細胞は順調に増殖はしましたが、剥がした直後にトランスフェクトをしたことがないので、どの程度損傷を与えているかわかりません。 振とう培養の方がお勧めです。シェイカーがあれば最悪実験室（室温）でも培養できますし、マスも稼げます。

(無題) 削除/引用 No.4258-4 - 2007/05/23 (水) 15:35:55 - バキュロ 早速有難うございます。 13friday 様 シントウ培養も検討しましたが、新しく購入しなければならないものもあり、今あるものでできる単層培養でもうすこし粘ってみようと思っています。 おお 様 現在使っている細胞は培地に順化させてあるもので、今使っている培地もそれと同じ物を使っています。 ちなみに無血清培地です。抗生物質も細胞の生育にあまりよくないと聞いたので入れていません(今のところコンタミはありません) たしかに浮遊している細胞にも生きていそうなものがあります。しかしトランスフェクションを行う際には培養上清を取り除く為、細胞数が足りなくなったりしないでしょうか？ ピペッティングを何回もするよりはセルスクレーパーを使って一気にはがしてしまったほうが細胞の状態がいいように感じたのですが･･･ 細胞をコンフルになるように播いても50%程しか付着しない場合は、時間を置いて付着する又は増えるのを待つしかないのでしょうか？ sf9細胞が始めてのため、基本的な内容の質問ばかりですみません。

(無題) 削除/引用 No.4258-3 - 2007/05/23 (水) 11:41:40 - おお かなり強力なピペッティングを何回もしてはがしてました。浮遊することもできる細胞なので、くっつかない細胞もいましたが、形態などで判断して健康そうならよしとして進めていいかと思います。けいだいを余やすすぎるとだんだんひねくれてくるようです。 あとバイチによってはadaptationが必要なことがあります。自分の持っている細胞のヒストリーなどもチェックする必要があるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.4258-2 - 2007/05/23 (水) 11:13:51 - 13friday 単層培養で、うまくいかずに、進めないのであれば、フラスコでの振とう培養に切り替えたらどうでしょうか？

sf9細胞の継代 削除/引用 No.4258-1 - 2007/05/23 (水) 10:19:03 - バキュロ 現在タンパク質を発現に使用するためにsf9細胞を単層培養しています。 継代の際、プロトコールにはピペッティングやディッシュをたたく事で細胞が剥がれると書いてありましたが、ピペッティングをしてもなかなか剥がれません。 そこでセルスクレーパーを使って細胞を剥がしていますが、それが原因かわかりませんが継代した後の細胞の付着が良くありません。 単層培養ということで付着用に処理済のティッシュを使っています。(浮遊細胞用のディッシュでは付着してくれませんでした。) sf9細胞は半分程度した再び付着することがないものなのでしょうか？ トランスフェクションに進みたいのですが、継代のたびに細胞の状態が悪くなりなかなか先に進めずに困っています。 ご教授よろしくお願いいたします。

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