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リアルタイムPCRのデータの比較 トピック削除
No.4257-TOPIC - 2007/05/23 (水) 01:19:32 - はつげん
リアルタイムPCRにおいて
違う実験間での遺伝子の発現量の比較を行う方法がないか伺いたいです。

具体的にはWTとKOマウスのある組織Aにおける遺伝子Xの発現をリアルタイムPCRで調べています。これまではWT vs KOで遺伝子Xを比較していました。その後、新たに組織Bでも遺伝子Xについて発現変化を調べました。

このとき組織A,Bを使って得られたそれぞれのデータをつかって遺伝子Xの組織A,B間での発現量の違いを比較できないでしょうか？

これまではSYBRGreenを使って、検量線による相対定量で非較をしてきました。今回、Ct値で比較しようと思ったりもしましたが、データの解析の段階でthresholdをどこにするかでサンプルのCt値が変わってきてしまう気がします。同一実験のなかに組織A,Bそれぞれのサンプルを入れて、やり直さないといけないのでしょうか？
　
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△Ct法で比較するなら 削除/引用
No.4257-5 - 2007/05/26 (土) 05:24:27 - あだむやん
thresholdラインの上げ下げができるのがrealtime PCRのいいところでもあり欠点でもあると思います。
ある意味、データを操作できるように思うからです。
thresholdラインの上げ下げは、PCRのGraphにおいて、liner scaleとlog scaleの両方ですべてのサンプルがきれいに増幅しているところに調整するべきで、thresholdラインをプラトーに近いところや、まだ立ち上がっていないようなところに設定することには意味がないと思います。そうやっていいところに設定した場合は、基本的に少々thresholdラインを上げ下げしても基本的には、’Ct値の差’は大きくは変わらないと思います。自験例ではほとんど差が有りませんでした。
組織A,Bについて、もし適切なハウスキーピングジーンを使用していれば、必ずしも同一PCRに入れてやる必要はないと思います。

(無題) 削除/引用
No.4257-4 - 2007/05/25 (金) 23:34:39 - はつげん
Aさんありがとうございます。
internal controlにはTBPを使っています。KOにより神経突起等の異常がおこってactin量の変化が起こるかもしれないためです(脳に興味を持っています)。

質問の意図としては、Ct法で相対定量をする場合のthresholdラインをどのように決めるかということです。ラインを上下に動かすことで、サンプルのCtを自由に変えることが可能なので、今回の場合、組織間の比較ができるのかいう点です。

例えば、組織Aについて行ったときのデータで、thresholdラインを下げることでinternal controlのCtを少なく、遺伝子Xのthresholdラインは上げることでCtを大きくできます。組織A内のみで比較するぶんには、WTとKO間の違いはthresholdラインが多少上下しようが安定したPCR反応でしたら維持されていますので結果は変わりません。
しかし、組織Bについて行ったときのデータではこの逆にすることで、internal controlと遺伝子XのCtの差を小さくすることができます。さきほどと同様で、組織B内のみで比較するぶんには、WTとKO間の発現変化の結果は変わりません。しかしこのCtをもとに、組織間で比較をすると、遺伝子Xは組織Bにおいて組織Aより発現量が高いということになってしまいます。

組織A,Bについてのサンプルを同一PCR反応内にいれてやり直さなければならないのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.4257-2 - 2007/05/25 (金) 22:28:38 - A
通常GAPDH、あるいはβ-Actinなどのハウスキーピング遺伝子の
発現量を使ってデータを正規化します。つまりはつげんさんの場合
なら組織A,BにおけるGAPDH、あるいはβ-Actinの発現量が同じに
なるようにテンプレートの量を調整するということです。
ただこのメッセージを投稿するにあたってウェブサーチしてみたら
以下のようなサイトが見つかりました。

http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/biobeat/contents.jsp?COLUMNPGCD=78855&COLUMNCD=76448&TYPE=C&BIOCATEGORYCD=7

リアルタイムPCRの場合、単にGAPDH、あるいはβ-Actinを使えば
いいというわけでもなさそうですね。組織によってどの遺伝子を
コントロールとして使うかある程度調べる必要がありそうです。

リアルタイムPCRのデータの比較 削除/引用
No.4257-1 - 2007/05/23 (水) 01:19:32 - はつげん
リアルタイムPCRにおいて
違う実験間での遺伝子の発現量の比較を行う方法がないか伺いたいです。

具体的にはWTとKOマウスのある組織Aにおける遺伝子Xの発現をリアルタイムPCRで調べています。これまではWT vs KOで遺伝子Xを比較していました。その後、新たに組織Bでも遺伝子Xについて発現変化を調べました。

このとき組織A,Bを使って得られたそれぞれのデータをつかって遺伝子Xの組織A,B間での発現量の違いを比較できないでしょうか？

これまではSYBRGreenを使って、検量線による相対定量で非較をしてきました。今回、Ct値で比較しようと思ったりもしましたが、データの解析の段階でthresholdをどこにするかでサンプルのCt値が変わってきてしまう気がします。同一実験のなかに組織A,Bそれぞれのサンプルを入れて、やり直さないといけないのでしょうか？
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