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訂正です 削除/引用 No.4251-10 - 2007/05/25 (金) 13:06:17 - くだん 何でか嘘を書いてました。 PBS／0.001％Tweenではなく、PBS/0.1% Tweenです。すいません。 それから、PBSではなくTBSを使った方が良いと思います。 あんまり意味ないかもしれませんが。

がんばってください 削除/引用 No.4251-9 - 2007/05/25 (金) 10:00:53 - くだん こんにちは。がんばってください。 よかったら結果も教えてもらえるとうれしいです。

Re:免疫染色の手順 削除/引用 No.4251-8 - 2007/05/25 (金) 02:16:23 - 免疫染色 くだんさん、詳しく丁寧に教えて頂いて有り難うございます。 固定時間、賦活化、免疫染色について本当にためになる事ばかりで大変助かりました。 マウスの準備が整いしだい、始めていきたいと思います。 お忙しいところ有り難うございました。

免疫染色の手順 削除/引用 No.4251-7 - 2007/05/24 (木) 11:55:53 - くだん 免疫染色の手順 ・脱パラ後、オートクレーブ（通常の滅菌プログラム）により賦活化。室温に冷えるまで待つ。 ＊自作賦活化液：クエン酸一水和物0.757gとクエン酸三ナトリウム二水和物4.82ｇを蒸留水200mlに溶解し保存液とする。使用時に蒸留水で10倍希釈。 ＊市販；DAKOの賦活化液。シグマではなかったです。 ＊賦活化とは、アルデヒドの架橋結合により埋没した抗原を加熱等により露出させる作業。でもそれだけでは説明できないことも多々あるので（凍結切片が賦活化で染まるとか）、本当の所はよくわからない。 ＊賦活化液のpHは重要。圧力も関係するみたい。なので、条件が不安定な電子レンジ処理よりも、オートクレーブ処理の方が再現性が高い。 ＊急冷が駄目な理由はよくわからない。でもしない方がよい結果が出る感じ。 ・切片をパップペンで囲む。 ・PBS　wash　5 min ×3回 ・DAKOのパーオキシダーゼブロックで内因性パーオキシダーゼをブロック。 ・PBS／0.001％　Tween wash×3回 ＊界面活性作用を持つTweenにより表面張力を減少させることにより、組織への抗体の浸透を促進させる。また非特異結合を減弱させる効果を期待 ・DAKOのプロテインブロックで非特異結合を除去　室温1h ・一次抗体反応　4℃ over nightか、室温で１から２時間反応 ・PBS-Tween wash 5min×3回 二次抗体反応：DAKO envision 室温1h ・PBS wash 5min×3回 ・DAKO DAB発色液で発色 これで駄目ならまた聞いてください。

組織採取の方法 削除/引用 No.4251-6 - 2007/05/24 (木) 11:46:03 - くだん こんにちは。パラホルムアルデヒドは４％／リン酸緩衝液です。これはルーチンな方法なので、作り方等はどこにでも書いてあります。市販もされているので、あれこれ考えるくらいなら買った方が早いかもしれません。 http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/article/4_PFA.htm 以下、方法を詳しく記載しますよ。マウスの腸管は細いので、ケント紙に腸管を展開しづらい時は、下記の糸でしばる方法も同時に試してみてください。 組織採取の方法 ・頸椎脱臼、開腹 ・噴門部で消化管を切断。胃をつまむ ・胃を軽く引っ張りながら、眼科ハサミで腸間膜と脂肪を腸管から外してゆく。引っ張られた腸管は、ひも状に取り出される。 ＊脂肪が腸管に有り過ぎると、包埋時に空気が泡状に残りやすく、とても薄切しにくい。 ・糸で腸管を何カ所か縛る。間隔は適当。５cm位か。 ・１０mlシリンジ／２５G針に冷パラホルムを吸い、腸管に固定液を注入。 ＊これによって内腔を適度に膨張させ、絨毛を伸張させる。ふくらませすぎない。圧力が高すぎて絨毛がバラバラになる。 ・外側（筋層側）からも固定液をかける。ソーセージ状になる。 ・胃とか大腸とか余計な腸管を切り離し、縛った状態で固定液に浸ける。 ＊あまり折れ曲がらないように注意。大きな容器に入れた方がいいかも。 ＊固定は４度で２時間。２４時間は長過ぎ。 ・PBSで洗う。この時、腸管の結紮した両端を切る。PBS中で内腔が広がったまま固定されていればOK。つぶれる様なら両端を切らず、そのまま７０％エタノールに漬ける。 ・７０％エタノール２時間 ・８０％エタノール１―２時間。このへんで両端を切る。 ・腸管を長軸方向（腸管の蠕動方向）に切断し、半円筒状にする。 ＊切断時に腸管を変形させない。出来そうになかったらそのまま次に進む。 ・９０％エタノール１−２時間 ・９５％エタノール１−２時間 ・100％エタノール２時間×３。オーバーナイト可。完全に脱水させる。重要。 ・キシレン３０分×３。完全に透徹させる。重要。 ・パラフィン１時間×３。 ＊組織が小さいので上記の時間で可。 ・包埋。切断面を下に（薄切する面に）して置く。 ＊半円筒状に切断してない場合はそのまま包埋する。薄切で切り進めば良い。 ・マイクロm位で薄切する。 ・コートしてあるスライドガラスにのせる。 ＊松波ガラスのMASコートを使っている。シランコートより使いやすい。 ・３７度で一晩乾燥させる。

Re:賦活化について 削除/引用 No.4251-5 - 2007/05/24 (木) 00:11:05 - 免疫染色 有り難うございます。 現在賦活化もうまくいっておりません。 pH、圧力、急冷など気をつけるところが多々あって工夫が必要なのですね。改善していきたいと思います。 マウス小腸（特に現在　duodenum）なのでパラホルムアルデヒドで固定するようにします。 パラホルムアルデヒドの場合、濃度は何％でPBS？で溶解、用事調整がよいのでしょうか？ まだ小腸の切片をはじめたばかりで、いろいろ調べているのですが、細かい工夫が必要なところがわからずに試行錯誤しているところでした。 重ね重ねお尋ねして申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

賦活化について 削除/引用 No.4251-4 - 2007/05/23 (水) 09:09:46 - くだん こんにちは。賦活化については、良い結果が得られているのなら、記載された方法で良いと思います。 ただそれでは抗原性が得られない場合、賦活化液のpH等、色々条件があるらしいので、変更した方がよいかと思います。以下は僕が行っている方法です。 ・ヒト材料を使っているなら仕方ないですけど、固定はホルマリンではなくパラホルムアルデヒドで。 ・市販の賦活化液（シグマ等）に切片を浸す。 ＊以前は自分で作っていたのですが、上記の様にpHの管理が面倒なので、今は買っています。ただちょっと高いです（１万円くらい）。 ・オートクレーブで賦活化。条件は通常の滅菌行程で。 ＊電子レンジに比べて時間がかなり長くなりますが、加熱にムラがなくなるのと、圧力も賦活化に影響するらしいので、こちらを薦めます。 ・オートクレーブ終了後、室温になるまで待つ。 ＊すぐにPBSに付けると（急冷すると）駄目らしいです。 ・PBSで数回洗浄。その後染色行程へ。 以下最初の投稿の補足です。 ・固定操作はスピードが大事なので、本当は還流がベストかもしれませんが、そうするとvilliが伸張しない状態で固定されてしまい、絨毛全長を出す事が困難なので、展開する方法がお勧めです。もちろん出来るだけ手早くです。 ・ケント紙でなく、ろ紙でも何でも良いです。ただケント紙は「こし」があるので使いやすいです。 ・貼付ける前に、腸間膜の脂肪は出来るだけ外した方がよいです。胃等を持ちながら、腸管の端を引っ張って、ハサミで腸間膜を腸管から外しつつ、腸管を一本にしてゆくと、きれいにできます。

Re: 小腸パラフィン切片 削除/引用 No.4251-3 - 2007/05/23 (水) 04:25:23 - 免疫染色 くだんさん、丁寧な御返答を有り難うございます。 これから試してみたいと思います。 ひとつお尋ねですが、免疫染色時のantigen retrieval は　どうされているか教えて頂きたいです。 現在、0.1M Sodium Citrate を使って電子レンジ　40% 5分、PBSでWash しています。 もし何か良い方法があれば教えて頂きたいです。 よろしくお願いします。

小腸パラフィン切片 削除/引用 No.4251-2 - 2007/05/22 (火) 09:33:09 - くだん 幾つか羅列しますよ。 ・１００％パラフィンオーバーナイトは、別に問題はないかもしれません　 　が、長すぎじゃないですか。 ・＜還流する場合＞腸の曲がってない所を選んで、円柱状に切り出します。 ・さらに長軸に半分に切って、切った面を下にして包埋し、薄切します。 ・＜還流しない場合＞ケント紙を短冊状に切って、用意しておきます。 ・腸管を取り出し、短冊の長軸と同じ方向に載せ、ケント紙にくっつけます。この時、腸間膜を下側、つまり短冊に接するように置きます。 ・余分な腸管をハサミで短冊ごと切断します。 ・カミソリやメス刃で、長軸に沿って腸管を切開し、さらにくっつけます。これで粘膜が露出し、かつケント紙に展開、固定された状態になります。 ・冷PBSを注射器に吸い、腸管粘膜の粘液を洗い流します。 ・冷ホルマリンに短冊ごと入れて、以降固定、脱水します。 ・脱水過程で組織が十分硬くなったら（７０か８０％アルコール置換時。ホルマリン固定時では多分、切り難い）、カミソリで組織を長軸方向に切り、切った面を下にして包埋します。この過程でケント紙は外します。

小腸　パラフィン切片作製について 削除/引用 No.4251-1 - 2007/05/22 (火) 01:28:03 - 免疫染色 ホルマリン固定からパラフィン切片を作製していますが、びらいがきれいにできません。 現在、ホルマリンで２４時間固定後、PBSでwash後、７０％エタノール　１時間→８０％エタノール１時間→９０％エタノール１時間→１００％エタノール　１時間→　Histoclear　１時間→５０％Histoclear　＋５０％　Paraffin １時間 ６０度 →100％Paraffin　overnight　６０度→パラフィンセクション。 固定する時、腸を切る大きさ、パラフィンブロック作製、カットの工夫など何か良い方法を教えて頂きたいと思います。 よろしくお願いします。

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