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(無題) 削除/引用 No.4235-9 - 2007/05/19 (土) 07:51:33 - 〜 無償で作り直しを要求するに私も同意します。 5-gagaattcNGAATTCNNNNNNNNN-3 3-ctcttaagNCTTAAGNNNNNNNNN-5 ↓クローニング 5-nnnnnnnnngAATTCNNNNNNNNNN-3 3-nnnnnnnnncTTAAGNNNNNNNNNN-5 EcoRI＋ターゲットの2bpが削れている。 というわけではありませんよね。 相補鎖に終始コドンのGAAがあるのが気になります。 始めにEcoRIで切ってクローング出来ることも説明できます。

失礼しました。 削除/引用 No.4235-8 - 2007/05/19 (土) 00:47:04 - SYBR_master 以前に同じような結果を持ってきた人がいて、それが下に書いた理由だったもんですから同じかと疑ってしまい、申し訳ありません。 結果から見て、単にprimerを再合成すればいいという話では無いと思います。 EcoRI siteを入れている訳ですから、たとえば 5-gaGAATTCNNNNNNNNNN-3 というprimerで、合成の不具合によりgaGAATTCNNが欠けているという事に成れば、最低でも8-10mer以上ミスっている事に成りますよ？これをQCで見つけられない合成会社ならもう使わない方がいいと思います。確かに合成は3末から作成するので5末におきやすいですけど、クレームどころの騒ぎではないですよ。合成時によっぽど長く(50 mer以上）でかつ精製しない場合、保証しないところはありますけど、自分なら無償で再合成させますね。単に配列がおかしくなっているならEcoRIできれなくなるだけで、欠損するとは思えません。 さらに不思議（って言ったらまずいんだけど）なのはblant-ligationでcloneが取れないというのもかなり？？？です。たとえprimerの合成が悪くてもblantでは入るでしょ(cloneが取れないというのがEcoRIで切れるのが無いというなら別ですけど）。それがEcoRIで切ったときだけclone化できるのは？？？？primerの配列がおかしくなっているならvectorとinsertの末端形状が全然合わないんですよ。insartは片側EcoRI-blantですから。 で考えられるのはhostがいやがっているためにその部分が欠損するからでは無いでしょうかね。なぜいやがっているのは不明ですけど(lacZとfusion proteinでもつくる？）。まあ、理屈には成っていないか、嫌がったとしてもEcoRIのone cutなら逆向きに入ればいいだけなような気もするし。作り直すなら制限配列も変えた方が無難な気がしますが、それで解決するかどうかは保証いたしかねます。 でprimerに問題が無い場合、productsの末端は 5-gaGAATTCNNNNNNNNNN-3 3-ctCTTAAGNNNNNNNNNN-5 で、EcoRIで切り出せば 5-AATTCNNNNNNNNNN-3 3-----GNNNNNNNNNN-5 という末端ですよね？でEcoRIとtargetの2baseが無くなるためには、ligationの前に5'-3' exonuclease活性が無ければいけませんが、使用したPrimeSTAR HS DNAにその活性があります？Taqはある（かなり弱いですけど）ので可能性が無い訳ではないですが、PrimeSTAR HS DNAがPyrococcus由来なら非常に可能性が薄い気がします。また、それが片側にしかおこらないのは明らかに理屈に成っていませんよね。 fidelityの高い酵素は3'-5' exoは高いのですが、5'-3'exo活性はほとんどないので削り込みでEcoRI(今回の場合vector側のAATTも含む？)も消失というのは可能性が薄いです。 EcoRI cutの前にpurifyしていないようなので、もしかしたらstar活性が出てたまたまstarのときの認識配列に問題のprimerが成っているのかもしれません。これならEcoRI cutの前にpurifyしておけば終了に成るけど。

(無題) 削除/引用 No.4235-7 - 2007/05/18 (金) 20:52:19 - PCR 質問にお答えします。 >4つ質問 >1.Sequence templateはPCR products、plasmidのどっち？ Plasmid。 ＞2.sequenceのquality checkはおこなっている？ 外注です。 ＞3.反対鎖からもsequence dataを取っている？ 取ってます。 ＞3.駄目元でplasmidをEcoRIで切ってみた? 切ってみました、切れませんでした。 ＞EcoRI siteだとprimerにかなり近いのでsequenceのqualityが低いため ＞base callで2baseほど重なりが出てerroe callされdeletion or　mutation＞しているようにtext dataが排出されている、もしくは近すぎてbase call＞すらしていない。で、text dataしか見ていないのでEcoRI siteがつぶれて＞いるように見えるので、まだplasmidを取って、EcoRIでclevageはしていな＞い。 おっしゃるとうりで、最初に気になったのでインサートの真ん中付近に新しくprimerを置いて再度シークエンスしました。結果は前述同様でした。

根本的に違う気がする 削除/引用 No.4235-6 - 2007/05/18 (金) 16:39:13 - SYBR_master 4つ質問 1.Sequence templateはPCR products、plasmidのどっち？ 2.sequenceのquality checkはおこなっている？ 3.反対鎖からもsequence dataを取っている？ 3.駄目元でplasmidをEcoRIで切ってみた? 予想だけども、 VectorがpUCだから、M13 primerでcolony-PCRを行い、そのPCR productsをM13 primerでterminatorで反応して、auto-sequencerで流している。EcoRI siteだとprimerにかなり近いのでsequenceのqualityが低いため、base callで2baseほど重なりが出てerroe callされ、deletion or mutationしているようにtext dataが排出されている、もしくは近すぎてbase callすらしていない。で、text dataしか見ていないのでEcoRI siteがつぶれているように見えるので、まだplasmidを取って、EcoRIでclevageはしていない。

(無題) 削除/引用 No.4235-5 - 2007/05/18 (金) 09:50:29 - PCR 皆様、ご意見ありがとうございます。 ＞削れた部分はプライマー内ですよね？ はい、そすです。 〜さんのおっしゃるとうり、削れたクローンをテンプレートにしてもう一度同じプライマーでPCRしてやってみましたが、やっぱり削れたクローンしか得られませんでした。そこで、PCR後にEcoRIで消化せずに、インサートをリン酸化してベクターのHinc IIサイトに放り込みましたが、こんどは全くクローンが得られませんでした。 ＞もし、ほとんどインサートをもったコロニーがでなくて、なんとかとれたのがそういうのだったと＞したら、ひょっとするとプライマーの合成エラーで、末端の配列がおかしいのかもしれません。 もしやとは思ってはいましたがやはりその可能性はあるのですね。今までこの様な事態に遭遇しなかったので困惑していました。もう一度、プライマーを合成してからやり直してみます。

(無題) 削除/引用 No.4235-4 - 2007/05/18 (金) 09:05:22 - gene 末端が削れた断片がたまたまベクターに入ったものがとれることはありますが、あくまでもアクシデントであって、すべてのDNA分子に同じ現象がおこるということは考えられません。 たくさんコロニーがでているなら、複数とればデザインどおりのものが大多数のはずです。 もし、ほとんどインサートをもったコロニーがでなくて、なんとかとれたのがそういうのだったとしたら、ひょっとするとプライマーの合成エラーで、末端の配列がおかしいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4235-3 - 2007/05/18 (金) 06:57:15 - 〜 コロニーPCR→ダイレクトシーケンスして、当たりのPCR産物をサブクローニング をしようとしているのでしょうか。 複数クローンを取ることが出来ないくらい、ゲノムから増やすのが難しいのでしたら、 取れているデリーション入りのベクターをテンプレートに、 gneomicPCRで使ったリンカー入りのプライマーで増やしてはいかがでしょうか。 ベクターからならば増やしやすいでしょうし、 削れた部分はプライマー内ですよね？

(無題) 削除/引用 No.4235-2 - 2007/05/18 (金) 00:16:12 - おお PCRにかぎらず、酵素処理後ライゲーションしてトランスフォーメーションすると、たまに1ベース削れていたりというクローンが得られます。理由は分かりません。もしかしたら酵素のスター活性かもしれませんし、ライゲーションのときたまたま環状になれなかった直さのものが、大腸菌内で環状に修復されてしまったとかいろいろ想像しています。 えーと、すべてのクローンでEcoRI siteが壊れてますか?単につぶれてないクローンを探せば良いと思うのですが。昔はコロニーPCRをせずにミニプレップ、酵素処理で確認というステップを取っていますので、目的の酵素できれないものはそこでおかしいプラスミドと判断することがたいていでしたが。 コロニーPCRをしないといけないほど効率が悪いなら、すこしサブクローンのシステムを見直した方がいいかもしれません。

polymeraseによる削り込み？ 削除/引用 No.4235-1 - 2007/05/17 (木) 22:54:56 - PCR 培養細胞から抽出したGenomeをテンプレートにしてPrimerにはEcoRIリンカー（NEBのカタログに従いEcoRIリンカーの外側に余分のヌクレオタイドを付加）を付けてPCRを行いました。PCR酵素にはPrimeSTAR HS DNA Polymerase(http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C2000)を用いました。PCR終了後にEcoRIで消化・ゲル抽してpUC19のEcoRIサイトにクローニングしました。colony direct PCR（M13 primerを使用）でスクリーニングしてクローンが得られました。しかしDNAシークエンス解析の結果、片側のEcoRIサイトとターゲットの2bpのみがそっくり無くなっていました。このクローンはEcoRIで切り出して発現ベクターに移し替える予定なのですが、これでは切り出せなくて困っています。原因の一つに、PCR酵素による削り込みが考えられたのですが、その場合一般的に片方のみなのでしょうか？KODやPfxではPCRで増幅できなかったのがこの酵素でやっとかかったので、解決できなかと思うのですが.......

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