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プロモーター領域のクローニング トピック削除
No.4230-TOPIC - 2007/05/16 (水) 23:58:36 - Tony
Promoter assayをするためにある遺伝子のプロモーター領域を切り出してreporter vectorにクローニングを試みています。プロモーター領域はBAC cloneから切り出した後、先ずはcloning vector (pGEM)に入れようとしているのですがどうしても入りません。Insertのsizeは2.0kbと然程長くは無く、際立ったGC-islandもありません。しかしながら5'末端付近には繰り返し配列が含まれています（約100bp程）。

現在までの結果から、どうもinsertの末端付近が何らかの高次構造をとっているため、これがligationに影響しているのではないかと推測しています。
Cloningの都合上、unique restriction site（Pst I）がここにあり且つ、候補のcis-elementがすぐ側にあるので何とかこのinsertをcloningできないものかと思案しております。

長くなってしまいましたが、質問は”高次構造を形成しそうなinsertをどうやったらcloningできるか？できない？”です。

皆様のご教授をお願いいたします。
尚、手短ではありますが下記に検討した条件を記載します。


Insert: From BAC clone。Pst I digestの後、ゲル抽(Qiagen)。
Vector: Pst I digestと脱リンの後、Spin column (Qiagen)で精製。
Ligation: 16度で1〜5時間。
Vector: Insert = 1:1〜5
　
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ＢＡＣから直接断片をプラスミドに移し変える方法もあります。 削除/引用
No.4230-6 - 2007/05/22 (火) 01:02:32 - 一産婦人科医
2Ｋｂ程度の短いフラグメントでやるのも何ですが、ＢＡＣから直接断片を目的のプラスミドに移し変える方法もあります。

(無題) 削除/引用
No.4230-5 - 2007/05/17 (木) 09:58:34 - gene
高次構造によるかどうかはさておき、本当にその断片がligation-resistantかどうかは、その断片だけでligationしてみて重合が起こるか否かをみれば確かめられます。

そこを押さえておかないと的はずれなことになりかねません

(無題) 削除/引用
No.4230-3 - 2007/05/17 (木) 09:21:56 - おお
コントロールを取った確認は私も賛成ですね。何が悪いかをしっかりさせた方がいいですから。
以外と簡単に見えてうまく取れないということはたまにあります。原因は分かりません。もしかしたら高次構造かもしれません。そのため私は2種類の方法をなるべく考えて並行してやるようにしています。でもなぜ高次構造を取っているのにPstできれたのかなという疑問もありますが、それが構造を否定するものでもないともいえますし。思い切ってブラントにして入れてみてもいいかもしれません。あとはアダプターをかましてpGEMかレポーターに直接ほりこむとか、、、高次構造がほんとに関与していると思える時は場合によりますが、１度そのフラグメントを90度ぐらいで変性させて、90度ぐらいのお湯の入ったビーカーに浮かせておいて放置することで、徐々に温度を下げていくと違った構造に落ち着く可能性がありますね。
あと、違う大腸菌株を使うとかです。これも株の表現系で説明がつかないけどうまく行くことがあります。より理論的にというのであれば、RNAiコンストラクトを作るための、より反復配列の安定性がたかい大腸菌株がありますので使ってみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.4230-2 - 2007/05/17 (木) 06:18:47 - 〜
当たりのクローンが取れないのが、
ゲルからの切り出し時に何か持ち込んでしまっていたり、
ライゲースが失活している
という原因で無いことはコントロールをおいて確認しているのでしょうか。

できるかどうかはわかりませんが、私なら、
１．ライゲーションキットと、単品の酵素＋バッファーの両方を試す
２．反応温度を4~20度くらいにしてみる
３．とにかくたくさんやる
で1週間くらい試して、
取れなければPCRでもう少し外側から増やしてサブクローニングします。

プロモーター領域のクローニング 削除/引用
No.4230-1 - 2007/05/16 (水) 23:58:36 - Tony
Promoter assayをするためにある遺伝子のプロモーター領域を切り出してreporter vectorにクローニングを試みています。プロモーター領域はBAC cloneから切り出した後、先ずはcloning vector (pGEM)に入れようとしているのですがどうしても入りません。Insertのsizeは2.0kbと然程長くは無く、際立ったGC-islandもありません。しかしながら5'末端付近には繰り返し配列が含まれています（約100bp程）。

現在までの結果から、どうもinsertの末端付近が何らかの高次構造をとっているため、これがligationに影響しているのではないかと推測しています。
Cloningの都合上、unique restriction site（Pst I）がここにあり且つ、候補のcis-elementがすぐ側にあるので何とかこのinsertをcloningできないものかと思案しております。

長くなってしまいましたが、質問は”高次構造を形成しそうなinsertをどうやったらcloningできるか？できない？”です。

皆様のご教授をお願いいたします。
尚、手短ではありますが下記に検討した条件を記載します。


Insert: From BAC clone。Pst I digestの後、ゲル抽(Qiagen)。
Vector: Pst I digestと脱リンの後、Spin column (Qiagen)で精製。
Ligation: 16度で1〜5時間。
Vector: Insert = 1:1〜5
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