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なるほど 削除/引用 No.4223-5 - 2007/05/18 (金) 08:08:43 - あだむやん pageさん、ありがとうございます。 b-actinはレドックスセンシティブなんですね。 なるほど。 non-reducing conditionにおいては扱いに 注意が必要ということがよくわかりました。 non-reducing conditionで、 GAPDHとか他のinternal controlとして有用なものは ありますでしょうか？ それとも、Aさんのご指摘のように、 正規化においてはreducing conditionでのb-actinを 使用してもかまわないのでしょうか？ というかそれ以外、確かめる方法がわかりません。。。。

(無題) 削除/引用 No.4223-4 - 2007/05/17 (木) 04:21:09 - page b-actinは非常にレドクッス感受性の高いタンパク質です。 intramolecularのジスルフィドを形成します。また、glutathionylationを うけることも分かっています。non-reducingゲルで見られる、2本のバンドは oxidized formとreduced formのアクチンでしょう。チオレドキシンなんかの 論文を見るとよく出ていますが、ジスルフィドを形成するとSDS-PAGEでの 移動度は見た目で分かるくらい変わります。 アクチンポリマーの形成は上で書いたようにレドックス感受性なので、 刺激によりフォームは変わりますし、未確認ではありますが、intermolecular disulfide bridgeを形成することによりアグル可能性もあるかと思います。 上述のチオレドキシンですが、non-reducing gelですとチオレドキシンが 多くのタンパク質とdisulfide intermediateを形成しているのがわかります。 サンプルごとに量が異なって見積もられたのは、こんな所が大きく影響している のではと推察されます。

ありがとうございます 削除/引用 No.4223-3 - 2007/05/17 (木) 01:00:35 - あだむやん Aさん、早速の回答ありがとうございます。 もちろん、目的蛋白はb-actinではありません。 以前のb-actinでの定量の妥当性についてのトピックは 読ませていただいてなるほどと思いました。 確かに、Signalの強度と蛋白の質量は正の関係にはならないと 僕も自分の実験経験からも思っています。 ただ、各Laneに正しく同量の蛋白を流したかどうか、という確認のためには 何がしかのinternal controlは必要なのでは、と思っています。 毎回Western直前にはProteinAssayで濃度を測定して、その後直ちに Loadingをはじめていますが、そのAssay自体も、そしてPipettingのエラーなども否定はできないというか、疑いだしたらきりがないからです。 では、non-reducing conditionでは どの蛋白がinternal controlに適切なんでしょうか？ GAPDHとかのほうがいいのでしょうか。 あるいは、ProteinAssayがきちんとできているという仮定のもとで、 b-actinがきちんとでてこなくても、 目的蛋白の評価（サンプル間で差があるかどうか）を してもよいのでしょうか？ やはりinternal controlをさがして同じメンブレンにBlotする ほうがよろしいでしょうか？ それから、もしご存知であれば教えていただきたいのですが、 non-reducing conditionではb-actinは２本のバンドになりますが、 なにが原因なんでしょうか？ 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4223-2 - 2007/05/16 (水) 23:12:06 - A 実は文意をはっきり捉えられていないのですが、 1.業者から買った抗体は「anti-b-actin抗体ではない」のですよね？ 2.ウエスタンブロットでb-actinを定量しそれによって各wellにのせた 総蛋白質量を正規化したいのですよね? もし購入した抗体がanti-b-actin抗体であるなら業者に実験結果を 示してなぜnon-reducing conditionを推奨しているのか確認する べきだと思います。 ************************************************************ 以下については購入した抗体がanti-b-actin抗体ではないことを 前提に書きます。つまり検出を目的としている蛋白質はb-actin ではないということです。 ************************************************************ >ブロットしますと（もちろん別々のメンブレンで）reducing condition >ではb-actinはばっちり均一にもかかわらず、non-reducing conditionは >均一にでない。ところが不思議なことに、時々はnon-reducing condition >でもb-actinが均一にでることがあります。 あくまで推測ですがこのanti-b-actin抗体をつくる際に抗原として変性 状態のb-actinを使ったからではないでしょうか。もしそうであれば この抗体が完全変性したb-actin（つまりreducing conditionの）を 均一に認識しやすいのは頷けます。時々non-reducing conditionでも バンドが均一に出るのはたまたまnon-reducing conditionとはいえ 他に比べ変性がすすんだからでは（例えば熱変性がより上手くいった など）。 >そして、この場合、non-reducing conditionで目的蛋白質の定量を、 >b-actinの定量をreducing conditionででてきたバンドで行う、 >ということは科学的に正しいことなのでしょうか？ 分子量や性質（電荷などを含む）の異なる２つの蛋白質のウエスタン ブロット上のバンドを比べて定量化することは理論的に考えて無理です。 分子量や電荷の違いによって移動度が違うでしょうし、抗体のロットに よってもどれだけの量の蛋白質を認識できるかは異なるからです。 コントロールとして蛋白質量のわかっている目的蛋白質（コントロール） を幾つかの濃度を振って同じ膜上にブロットし比較するしかありません。 同じコントロールさえ使えばそれをインターコントロールとして異なる 膜上の目的蛋白質の量を定量的に比較できるはずです。 ブロットされたb-actinの量によって各wellにのせた蛋白質量を正規化する のであればnon-reducing condition、reducing conditionの２つのゲル上に 同じ量の蛋白質さえのせれば理論的には比較できるはずですから正規化に 使っても問題ないのでは。 ただウエスタンブロットによる定量化については以前も幾つかトピックが あったのですが結論としては、理論的には定量化できるが非常に難しい といったかんじの結論だったと思います。

ウエスタン　non-reducing conditionについて 削除/引用 No.4223-1 - 2007/05/16 (水) 03:41:25 - あだむやん ウエスタンで私が使っている抗体は、業者（Abcam）からのデータシートによるとnon-reducing conditionが推奨されています。 マウスの大動脈の平滑筋細胞を、Lysis Bufferで溶かし、 non-reducing conditionのサンプルバッファーを用いて ウエスタンを行いますと、時々b-actinが均一にでないことがあります。 不思議に思って、全く同じサンプルを同じ蛋白量だけ、 同時にnon-reducing conditionとreducing conditionとで ブロットしますと（もちろん別々のメンブレンで）reducing conditionではb-actinはばっちり均一にもかかわらず、non-reducing conditionは 均一にでない。ところが不思議なことに、時々はnon-reducing conditionでもb-actinが均一にでることがあります。 ようするに、non-reducing conditionでは安定してb-actinがでないのです。 なにが原因でしょうか。 そして、この場合、non-reducing conditionで目的蛋白の定量を、b-actinの定量をreducing conditionででてきたバンドで行う、ということは科学的に正しいことなのでしょうか？ non-reducingとreducing conditionの違いは、単にb-MEのあるないだけだと 思っていたのですが、こんなにも違うのかと驚くと共に、non-reducing conditionでの難しさを痛感しており、なんとか安定しないものかと思案しております。 Lysis Buffer・・・・Cell signalingの１０ｘのものを使用 Protease Inhibitor Cocktail・・・Sigmaのものを使用 サンプルバッファー・・・・dH20 3.25ml, 1M Tris pH6.8 1.25ml, Glycerol 2.5ml, 10%SDS 2.0ml, 0.5ml BromophenolBlue 0.5ml reducing conditionにする場合は、これにb-MEを5％くらいの濃度で混ぜてboilしてからサンプルをloadしています。

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