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(無題) 削除/引用 No.4218-5 - 2007/05/21 (月) 05:43:20 - Yuki おおさん、アドバイス有難うございます。感謝です。お礼やお返事が遅れて済みませんでした。あれから文献を調べ直しました。やはりウエスタンをやっている方はいませんでした…。 K-1さんやおおさんのおっしゃるように、一度pelletに目的のタンパク質がどれだけ残存しているか調べてみます。 こちらでやっているウエスタンはセミドライです。ブロッティングbufferは0.4% SDSの入ったものを使用しています。5cm×5cmのミニゲル一枚につき50mA const.でブロッティングです。今までのところ、このやり方でcontrolのβ-Actinはきれいにでています。SDS-PAGEもラボの人たちがやっていて問題ないとした一般的なやり方でやっています（ちなみにrunning bufferは共用です）。心配なのは抗体です。モノクローナルではなく抗血清を使用しており、4000倍希釈で4℃ O/Nで施行してます。 多くの文献ではこのタンパク質の精製はNP-40のS-100 fraction lysateから始めていました（一部の文献では1%TritonX-100を使っているものも有りました）。そこからアフィニティカラムにかけたりして精製度を上げていっています。ウエスタンで定量するだけの私にはfractionのlysate位までで良いのでしょうか？。またこのNP-40などの処理でDNAからこのタンパク質を解離させることが出来ていると考えてよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4218-4 - 2007/05/17 (木) 10:46:15 - おお もしかしたらストックすることによるというよりむしろウエスタン自身のばらつきかもとも思ったのですが、その可能性はないですか? 確かにdegradationを気にするのであれば、変性状態で保存するというのがいいと思います。SDSPAGE用にそのようにして取っておくのがいいと思います。定量ということで、発現量を知りたいのであれば、１度そのバッファーで抽出した跡遠心したあとのペレットに目的のタンパクが残ってないか見ておいた方がいいでしょうね。あるいは細胞をサンプルバッファーで直接溶解するか。 >また、簡易なTriton処理だけでDNA結合能を持つと考えられる(leucine zipperモチーフを有している)タンパク質をDNAと分離させ、可溶化出来るのでしょうか？ これはyesでありNoでもあります。タンパクによるでしょうし、必ず初めに確認するべきですが、まともにキャラクタライズしてやっている人がどれだけいるか、、、と疑問に思うことがあります。 核たんぱく質を抽出するためにクロマチンの構造が壊れる高い塩濃度(600mMKCl)などを使う方法があります(KClはSDSとまぜると沈殿するのでちょっとやっかいですがNaClでも代用できると思います)。 一度ご自身でいろいろと確かめてみてはどうでしょうか。

TK-1さん、有難うございます 削除/引用 No.4218-3 - 2007/05/16 (水) 00:46:39 - Yuki TK-1さん、アドバイス有難うございます。 −80℃で保存していた上清サンプルのストックを使ってウェスタンする度に、測定値が大きくばらついたのは、やはり解凍時などにおけるタンパク質のdegradationが原因だったのでしょうか？他の可能性は無いでしょうか？degradationが原因なら、解析する度に細胞からfreshな上清サンプルを抽出し使うか（これが一番確実かな）、アドバイスにあったように、denatureさせて保存してあるサンプルを使うか、何れかなのですね。 文献を見ると、細胞からのこのタンパク質の精製にはTritonやNP-40、またはTween-20などのlysateが使われてました。精製するのは難しい（notoriousと記されていた）ものらしいです。こちらは各細胞株の相対的な発現量を知りたいのですが。ウェスタンで定量したという論文は見当たらないのです。

(無題) 削除/引用 No.4218-2 - 2007/05/15 (火) 22:04:23 - TK-1 > ウェスタン自体はノンスペのバンドも無く、目的のバンドも鮮明に出てうまくいっているようです。しかし果たしてそのバンドが細胞の正確な発現量を反映しているのか疑問です。抽出したての上清タンパク質では予想していた値が出ましたが、プロテアーゼインヒビターを加え−80℃で保存していた上清サンプルを使用してウェスタンをすると、やる回ごとに値にばらつきが出てしまうのです。やはりfreshなサンプルでないとdegradationなどが起こり、正確な定量が出来ないのでしょうか？ちなみにサンプルは凍結・融解を繰り返さない為に、サンプルは１回分ごとに分注していました。細胞のサンプルは貴重でしたので仕方なく凍結保存していたのですが。 他のスレッドにも出ていましたが、westernだけが目的であれば上清を取って定量したあとにsample bufferを加えてdenatureしておけばdegradationは無視できる範囲内に収まると思います。 > また、簡易なTriton処理だけでDNA結合能を持つと考えられる(leucine zipperモチーフを有している)タンパク質をDNAと分離させ、可溶化出来るのでしょうか？他の人は問題ないのでは、と言っておりますが、自分では疑問を払拭出来ずにいます。 細胞を溶かしたあとのペレットをSDS sample buffernに溶かして並べて泳動すればわかるともいます。

DNA結合能を有するタンパク質の調整 削除/引用 No.4218-1 - 2007/05/15 (火) 15:26:49 - Yuki 現在扱っているタンパク質の調整のことで疑問が有りましたのでお訊きしたいと思います。DNA結合能を持つと考えられるタンパク質の細胞株ごとの発現量をウェスタンブロットで解析しています。 トリプシンで剥がした細胞をPBSで洗浄、10^6個あたり20μlの1% TritonX-100 PBSをpelletに加えサスペンドして細胞を壊し、10000gで10 min遠心、上清を回収し、SDS-PAGEサンプルバッファー& beta-MEと混合、95℃ 5minでボイルしてSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングに供しています。 ウェスタン自体はノンスペのバンドも無く、目的のバンドも鮮明に出てうまくいっているようです。しかし果たしてそのバンドが細胞の正確な発現量を反映しているのか疑問です。抽出したての上清タンパク質では予想していた値が出ましたが、プロテアーゼインヒビターを加え−80℃で保存していた上清サンプルを使用してウェスタンをすると、やる回ごとに値にばらつきが出てしまうのです。やはりfreshなサンプルでないとdegradationなどが起こり、正確な定量が出来ないのでしょうか？ちなみにサンプルは凍結・融解を繰り返さない為に、サンプルは１回分ごとに分注していました。細胞のサンプルは貴重でしたので仕方なく凍結保存していたのですが。 また、簡易なTriton処理だけでDNA結合能を持つと考えられる(leucine zipperモチーフを有している)タンパク質をDNAと分離させ、可溶化出来るのでしょうか？他の人は問題ないのでは、と言っておりますが、自分では疑問を払拭出来ずにいます。 初歩的な質問で済みません。

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