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GST融合タンパク発現のソニケーションで懸濁液が透明にならない トピック削除
No.4211-TOPIC - 2007/05/13 (日) 12:04:50 - けい
現在、三種類のある転写因子（GST融合後の推定上の大きさ、Ａ;40kD，Ｂ60kD;，Ｃ;90kD）をGSTに融合させ（pGEX vector)融合タンパク質の作成を試みています。

融合タンパク質をIPTG誘導で発現させ、その後、大腸菌をソニケーションで破壊するステップがあると思うのですが、このときに少々疑問が生じました。

プロトコールを見ると懸濁液が透明になるまでソニケーションしろと書いてあり、実際にGSTのみを発現させた大腸菌とAの融合タンパク質を発現させた大腸菌では懸濁液が透明になります。Bはソニケーション前と比べ多少は透明になります。Cはソニケーションしても透明になりません。

それぞれのタンパク質の発現量はGST = GST-A fusion > GST-B fusion > GST-C fusionの順です。（Cは目的長の融合タンパク質ができませんでした）。この現象は、BL21大腸菌でもRosettaでも見られ、培養時の温度を１８度から３７度までふっても同じ傾向が見られました。また、ソニケーションの時間を長くしても改善は見られませんでした。

ソニケーション後の透明度と目的タンパク質の発現量になんらかの関連はあるのでしょうか？また、もしあるとしたら、どうしたら透明にすることができるのでしょうか。

どなたか、ご存知の方、同じような経験をされた方がいらしゃいましたら、助言をお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4211-7 - 2007/05/13 (日) 15:13:12 - TS
透明に。。。なりますか？
菌体がたくさんあるのに、完全に透明になることはないと思うんですが。
（透明かどうかは主観にもよりますけど）

SonicationやDetergentで抽出かけた後に遠心しますよね。その上清は透明になりますし、それで十分だと思います。

わたしは、ちなみに透明になった経験はありません。いつも濁ってます。
それでいつもタンパク質が十分取れてます。

(無題) 削除/引用
No.4211-6 - 2007/05/13 (日) 14:33:38 - おお
あまり透明になるというところに気を取られる必要はないと思います。非常に高発現inclusion bodyができている可能性がありますが、可溶性画分にでたたんぱく質が欲しい時は、遠心したじょうせいにたんぱく質が来ているかどうかを見ればよいと思います。

(無題) 削除/引用
No.4211-5 - 2007/05/13 (日) 12:55:05 - けい
>[Re:3] mimiさんは書きました :
> 失礼、もしすでにホールをサンプルバッファー
> で破砕して発現量を確認済みなら、下記の内容は
> 当たらないですね。

ご助言、ありがとうございます。
ホールは一度試したことがありますが、そのときは量が多くて目的のバンドがどれであるか判別できませんでした。もう一度、濃度をふって試してみます。

(無題) 削除/引用
No.4211-3 - 2007/05/13 (日) 12:17:26 - mimi
失礼、もしすでにホールをサンプルバッファー
で破砕して発現量を確認済みなら、下記の内容は
当たらないですね。

(無題) 削除/引用
No.4211-2 - 2007/05/13 (日) 12:13:39 - mimi
おそらく、@菌体量が破砕バッファーに対して極端に多いか、
A不溶性で発現している割合が多いのでしょう。
特に、不溶性で大量発現している時に良く濁って見えますが
気にせずそのまま遠心後に上清を回収すると幾らかは、
水溶性に回収されていることも良くあります。
従って、濁ったままのものから上清を回収しSDS-PAGEで
展開してみることをお勧めします。
もちろんホールとペレットのコントロールも忘れずに。

GST融合タンパク発現のソニケーションで懸濁液が透明にならない 削除/引用
No.4211-1 - 2007/05/13 (日) 12:04:50 - けい
現在、三種類のある転写因子（GST融合後の推定上の大きさ、Ａ;40kD，Ｂ60kD;，Ｃ;90kD）をGSTに融合させ（pGEX vector)融合タンパク質の作成を試みています。

融合タンパク質をIPTG誘導で発現させ、その後、大腸菌をソニケーションで破壊するステップがあると思うのですが、このときに少々疑問が生じました。

プロトコールを見ると懸濁液が透明になるまでソニケーションしろと書いてあり、実際にGSTのみを発現させた大腸菌とAの融合タンパク質を発現させた大腸菌では懸濁液が透明になります。Bはソニケーション前と比べ多少は透明になります。Cはソニケーションしても透明になりません。

それぞれのタンパク質の発現量はGST = GST-A fusion > GST-B fusion > GST-C fusionの順です。（Cは目的長の融合タンパク質ができませんでした）。この現象は、BL21大腸菌でもRosettaでも見られ、培養時の温度を１８度から３７度までふっても同じ傾向が見られました。また、ソニケーションの時間を長くしても改善は見られませんでした。

ソニケーション後の透明度と目的タンパク質の発現量になんらかの関連はあるのでしょうか？また、もしあるとしたら、どうしたら透明にすることができるのでしょうか。

どなたか、ご存知の方、同じような経験をされた方がいらしゃいましたら、助言をお願いします。
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