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血清が効きました 削除/引用 No.4209-6 - 2007/05/30 (水) 13:48:47 - バキュ夫 いろいろとご意見を頂いていたのに、返事が遅くなり申し訳ありません。 まずは手軽なところで、ヨトウガさんのご意見を参考にして培地に血清を加えてみたところ、Sf9は調子よく増殖しています。 初めに5% FCSを加えたSf900IIで起こし、翌日に同じ培地で培地交換したところ、非常に元気に増殖を始めました。4日に1度継代し、継代の度にFCSの量を5%→2%→1%と下げていきましたが、元気な状態を維持しています。ただ、一方で浮遊している細胞も多かったので、それを除去する目的で2日ごとに培地交換したところ、現在は接着がよくて元気な細胞ばかりになりました。 おかげさまで、もうすぐトランスフェクション→発現と進むことができそうです。ご意見をくださった皆さまに御礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4209-5 - 2007/05/14 (月) 00:28:17 - ゆっくり凍結 もちろん、-80℃冷凍庫内でゆっくり凍結させる操作（たとえば最低でも発砲スチロールで覆う）はやっていますよね？ 細胞によりますが、-80℃で凍結させたあと、普通は、３日以内くらいに液体窒素にもっていくとおもいますけど？ 細胞によりますが、融解はなるべく速くやる（半解凍はまずい）のが基本です。

(無題) 削除/引用 No.4209-3 - 2007/05/13 (日) 22:15:13 - ヨトウガ 起こした直後は10％FCS添加SF900IIにて培養するのがお勧めです。増殖が安定したら半量抜く、もしくは無血清に変えても問題ないはずです。

re:Sf9細胞が凍結ストックから起きる効率 削除/引用 No.4209-2 - 2007/05/13 (日) 13:36:56 - TUS Sf9はあまり起きのよくない細胞ですので、安定して増えだすまでに時間がかかる場合があります。もちろん最適な状態で細胞を保存した場合ですが。-80度で４ヶ月は少し厳しいかもしれません。それとあまり薄い細胞濃度からは増えにくいので、ストックを作るときも濃いめに調製した方がよいと思います。液体培養(ロール瓶などを使って)がより効率的だと思います。一度良い状態で増えだすとかなりの量の細胞が取れてきますよ。時々、付着性が弱まって、浮いてくる細胞がみられますが、そういう細胞は遠心でのぞいて、接着する元気のよい細胞をセレクションするのもコツかと思います。この操作は細胞が増えだしてからですが。。

Sf9細胞が凍結ストックから起きる効率 削除/引用 No.4209-1 - 2007/05/12 (土) 17:56:23 - バキュ夫 凍結ストックしておいたSf9を起こして培養しようとしているのですが、起きる効率が悪く、使い物になりません（ほとんど全滅）。 Sf900II培地で培養し、調子のよかったSf9、2×10e6個をセルバンカー・プラス1mLに懸濁し、そのまま-80℃で凍結させました（哺乳類細胞でいつもそうしているので、深く考えずにそうしました）。そのまま-80℃で保存していたものを4か月後に同じ無血清のSf900II培地で起こそうとしています。 手順は「ストックを半解凍→10mLのSf900II（27℃）に懸濁→遠心1krpm×5min→5mLのSf900IIに懸濁→6cmディッシュに播種→27℃で培養」です。 何かコツとか（あるいは「その方法じゃマズいよ」とか）ありましたら、ご教授ください。よろしくお願いいたします。

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