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(無題) 削除/引用 No.4205-7 - 2007/05/12 (土) 12:21:12 - 司馬遷 皆様、親切でご丁寧な回答ありがとうございました。 早速試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4205-6 - 2007/05/12 (土) 12:13:40 - gene 吸収のしかたはいろいろあると思いますが、 １．アセトンパウダーをつかう。対象の細胞や組織のホモジネートに冷アセトンで処理して沈殿を乾燥、粉末化する。 2. 対象とする標本と同様のもの（例えば固定した細胞）を使う。 これを抗体希釈液に適当量加え、しばらく放置したのち、上清を使います。 アセトンパウダーで吸収する方法は、Molecular Cloningにも融合タンパク質で免疫した血清を大腸菌で吸収する方法が出ていたと思うので参考にしてください。 抗体希釈液を一回限りで捨ててしまうのではなく、使いまわすというのも吸収と同等の効果があります。使いまわすのは抗体がもったいないから、というのが動機だったりしますが、後になるほどきれいに染まるということは良く経験します。 なお、特異的抗体も吸収によって減るはずですが、ふつう完全に吸収されきるということはまずありません。

(無題) 削除/引用 No.4205-5 - 2007/05/12 (土) 11:44:14 - gene ブロッキングの時間を延ばすことで改善するのは望み薄だと思います。 吸収してから使うのは良い対策だと思います。 抗体の希釈率を上げるのは試してみましたか？ ネガコンで染まらないくらいまで希釈してみては。それで、シグナルが薄くなる、消えるようでしたら、反応時間を一晩くらいまで伸ばして見ましょう。 理論的には、特異的な抗原抗体反応は結合係数が高いので、希釈しても、反応速度が遅くなるにしても、反応は進みます。結合係数の低い非特異的な反応は、希釈により反応性が急激に落ちます。

(無題) 削除/引用 No.4205-4 - 2007/05/12 (土) 11:43:51 - 通りすがり 自分もblockingの時間を長くして免疫染色で 改善された経験はほとんどなく怠け者さんの意見に賛成です。 15分でやってもまる1日やっても全く変わらんです。 長すぎるとカビとか生えてきて逆にノイズみたいなのいっぱいでてきます。 濃度をあげたりしてもあんまりかわらず、 時たまserumからBSAやgelatinに変えて 効果があるときなどありますが稀です。 免疫染色についてはwesternとか他の抗体を使う実験系ほど blockingの影響はそれほど大きくない気がします。

(無題) 削除/引用 No.4205-3 - 2007/05/12 (土) 11:36:53 - 司馬遷 ご回答ありがとうございます。 抗体の吸収とは具体的にどのようなことでしょうか。染色の初心者で同じ研究室内に染色に詳しいものがいないためお教えください。 現在の実験系では、目的とする蛋白を発現している細胞数は培養細胞の中でかなり少ないのでなるべく非特異的反応を減らそうと考えております。１次抗体も２次抗体も現在より薄くするとシグナルが減弱してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.4205-2 - 2007/05/12 (土) 11:28:11 - 怠け者 以前私は週末にサンプルをブロッキングバッファーに入れて放ったらかし月曜まで置いておいた事がありますが何の問題もありませんでした。ですので3日間は放置できると思います。 ただ、ブロッキングは長くしても全く改善しないと思います。ブロッキングなしでも良いくらいですので。抗体を吸収して使ってみたりされましたか？

ブロッキングは何分まで可能でしょうか 削除/引用 No.4205-1 - 2007/05/12 (土) 11:04:11 - 司馬遷 ヒト由来の培養細胞を間接法により免疫染色を行っています。LabTechChamber上に培養し、PHAにより１０分間固定、ブロッキング３０分、一次抗体反応６０分、二次抗体反応６０分、いずれも室温で行っております。洗浄はPBSを各ウエルに入れ、ゆすいで吸引するのを各ステップで３−６回行っております。目的とする抗体による染色でもrabbit IgGによる陰性コントロールでも非特異的染色がかなり目立ちます。そこでブロッキング時間を延長しようと思うのですが、何分くらいまで可能なものでしょうか。延長するといっても頭打ちでこれ以上時間を長くしても意義がないものでしょうか。 詳しい方よろしくお願いいたします。

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