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(無題) 削除/引用 No.4203-2 - 2007/05/12 (土) 02:55:50 - おお lysis bufferはそんなにおかしくないと思います。したがってサンプルバッファーかえいどう自身を疑ってみてください。まずマーカーはキレイに流れているでしょうか。マーカがうまくいっているならサンプルバッファーをチェックするのがいいと思います。サンプルバッファーに必要な物は十分量のSDSと還元剤(DTTかbeta-ME)です。還元剤は室温で徐々にダメになって行きますので、保存の仕方も問題になるかもしれませんね。 とにかく作り直してみてはどうでしょうか。あとプレキャストをお使いの場合は、若干違うバッファー、アプローチをしていると思いますので１度マニュアルをよく見てみる必要があるかもしれません。 そうそうclassicなSDSPAGEではえいどうそうのバッファーにSDSを入れなかったためうまく流れなかったという人がいました。 従来40kDaあたりには結構たんぱく質があると思います。

細胞をlysis後SDS-PAGE 削除/引用 No.4203-1 - 2007/05/12 (土) 01:30:10 - あや マクロファージ様細胞のタンパク質をSDS-PAGEで展開し、western blottingであるタンパクを検出しようとしています。 しかし、SDSの結果を見ると、分子量の大きいタンパクのバンドはたくさんあるのですが、40kDa以下のタンパクはほとんど見られません。 またwestern blottingで検出したいタンパクは分子量が小さい(20kDa前後)のですが検出できず、非特異のバンドも見られません。 細胞をPBSでwash後lysis bufferを加え氷上で20分置いてから細胞を回収し、15000rpmで5分遠心し上清をサンプルとしています。 lysisに用いるバッファーが悪いのかと思い、３種類試しましたが結果は変わりません。 �@50mM Tris-HCl(pH8.0),5mM EDTA,150mM NaCl,1% Triton X-100, 0.1mM PMSF,protease inhibitor cocktail �A10mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,2mM EDTA,0.5% NP-40, 1% Triton X-100,0.2mM sodium orthovanadate,0.2mM PMSF �BRIPA lysis buffer (TBS,1% Nonidet P-40,0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS,0.004% sodium azide,PMSF,protease inhibitor cocktail,sodium orthovanadate) うまくいかない原因が何なのかわからなくて困っています。 アドバイスある方いらっしゃいませんか？

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