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ありがとうございました 削除/引用 No.4203-22 - 2007/05/26 (土) 00:40:08 - あや western blottingに使う抗体を変更したらバンドが検出されるようになりました。 サンプル調製はできてたみたいです。 ご助言ありがとうございました。

Laemmli 削除/引用 No.4203-21 - 2007/05/14 (月) 23:38:13 - あや Laemmliって普通のサンプルバッファーのことだったんですね。 ありがとうございます、覚えておきます。 細菌のlysateを作るとき、液体培地を遠心で除いてサンプルバッファーで懸濁し、遠心して上清を電気泳動しているのですが、原理としてはこれと同じですよね？ こんな簡単な方法が細胞でもできるなんてびっくりしました。 やってみます。

(無題) 削除/引用 No.4203-20 - 2007/05/14 (月) 08:07:00 - gene すでに回答ありましたが、Laemmli(Laemmli's sample buffer)は、いわゆるサンプルバッファーのことです。単にサンプルバッファーとすると誤解があるかもと思って固有名詞にしたんですが、かえって混乱させてしまいました。 Laemmliで直接可溶化した場合、必要なら遠心して上澄みを泳動してください。あんまり欲張ってたくさんのせないほうがきれいに流せます。 先の質問で 「パンスー」→　メンブレン上のタンパク質を染める、ponceau S だと思います。ポンソーのほうが通りが良いと思いますが、欧米人はそう発音するのかー

(無題) 削除/引用 No.4203-19 - 2007/05/14 (月) 04:35:09 - TS I think.. Your SDS sample buffer is Laemmli's buffer. Or pretty similar. Usually so is it. Just remember that you have to fragment DNA by passing through syringes or ultra-sonication when you prepare the samples with sample buffer. Otherwise, the sample solution can be viscous.

可溶化 削除/引用 No.4203-18 - 2007/05/13 (日) 23:18:15 - あや Laemmli bufferだと直接細胞を可溶化できるんですね？ 試してみたいんですが、うちのラボにあるかどうか…。確認してみます。 ちなみにSDS sample bufferでは細胞を直接可溶化できませんか？ Laemmli はすぐ手に入らない可能性が高い気がするので…。 初歩的な質問ですみません。

(無題) 削除/引用 No.4203-17 - 2007/05/13 (日) 23:00:41 - gene 私も、実験書に書かれている方法にしたがって、抽出をしたのですが、それでもだめなときはだめで、ちゃんとバンドがでないことはありました。 あか抜けない方法かもしれませんが、結局、Laemmliで直接可溶化してしまうのが一番簡単、確実な方法ではないかと思っています。Laemmliにけんだくしてボイルすれば、分解もなく-20度で保存できます（SDSを加えてボイルしているのだから大丈夫だろうと、4度でしばらく保存したら、明らかに分解が起こっていましたが）。 この方法だと、タンパク質量の定量が困難になる、ゲノムDNAがサンプルの粘性をあげて扱いづらかったりからまってバンドが乱れるという問題はあるかもしれません。細胞数あたりとか湿重量あたりで加えるLaemmliの量を決めれば、おおよそサンプル間の濃度はそろいますし、どうしてもDNAがじゃまなときは注射針に通すとかしてせん断すれば、なんとかなります。 ８時間の経時サンプルというのは大変ですが、まずは予備実験で適当なサンプルで試してみてはいかがでしょう。

geneさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.4203-16 - 2007/05/13 (日) 22:06:49 - あや 細胞をlysisさせて遠心等して調製したあと、-20℃で凍らせています。 そして翌日にSDSサンプルバッファーを加えて電気泳動しています。 サンプルを濃縮する場合も、lysisさせたあと同様に保存し翌日にTCA沈殿してサンプルバッファーに溶解してます。 この保存方法は問題ありでしょうか？ サンプリングを８時間行っていて全部調整してから泳動するのは時間的にきついかな、と思いlysisした直後に泳動したことはまだないのですが…。 私が今やっている実験は同じラボでやっている人がいなくて、論文を参考にしながら手探りでやっている状態です。 protein inhibitorなどは２年くらい前に購入したものかもしれません。一応凍らせて保存されていましたが…。 指導教官はprotein inhibitorは入れなくてもいいけど、とりあえずいれてみようか、みたいなことを言っていたのですが、普通いれますよね？

(無題) 削除/引用 No.4203-15 - 2007/05/13 (日) 20:53:00 - gene ＞低分子量のマーカーはきちんと流れていたと思います。 マーカーがきれいに分離していたということは、ゲルや泳動の問題ではなく、サンプル固有の問題のように考えられますが、 ＞同じラボの15%のゲルを使っている人で、ゲルをゲル板に流しこむ前に脱気している人がいます。私はしていなかったのですが、脱気したほうがいいのでしょうか？ しないよりしたほうがいいのは確かです。 脱気しないと溶液に溶け込んでいる酸素のために、重合が遅くなったり、重合しきらなかったりする可能性があります。ASPやTEMEDの劣化でも同様のことが起こります。ゲルが固まるのに異常に時間がかかるようだと、できたゲルの分離性能も良くありません。あと、SDS-PAGEではあまり問題にはならないかもしれませんが、アクリルアミドのストック溶液は、時間とともに分解してアクリル酸を生じ泳動に影響を与えるといいます。そのような兆候があるようでしたら、脱気、試薬を新しいものにかえるなどしたほうが良いかもしれませんね。 私は、ちょっとちがう可能性を考えるのですが、 タンパク質の分解ということはないでしょうか。 lysateをとってから泳動までの、保存期間や保存状態は妥当なものでしょうか。 あるいは、protease inhibitorはちゃんと働いているのでしょうか。 おそらく、あなた自身やあなたのラボでは日常的にやっていてうまくいっている手技なのだとは思いますが、、、、 文面から伺える症状は、古くなったサンプル（出来立てのときは大丈夫だったやつでも）や、変性剤を入れないnativeな抽出をして分解を完全に抑えることができなかった場合の私の経験に似ています。高分子も影響あるでしょうが、見た目には特に低分子のバンドがぼやけたり見えなくなったりします。 おそらくそうしないのは目的があってのことでしょうが、細胞を直接Laemmliでlysisしてすぐ泳動しても同じ症状でしょうか。

電気泳動？ 削除/引用 No.4203-14 - 2007/05/13 (日) 20:13:26 - あや みなさん、ありがとうございます。 低分子量のマーカーはきちんと流れていたと思います。 ご指摘いただいて、CBB染色の結果をもう一度確認してみました。 今までサンプルの低分子量のバンドが薄くて少ないことばかり気にしていて気がつかなかったのですが、隣同士のレーンに流したサンプルで、同じ大きさのバンドと思われるものがまっすぐ並んでおらず、波打つように並んでいました。 サンプルがきれいに泳動されていないってことですよね？ 15%のゲルで泳動してるんですが、この硬さのゲルを扱うのは初めてだったのでゲル作りがうまくいってないのかなぁ、と思い始めてます。 同じラボの15%のゲルを使っている人で、ゲルをゲル板に流しこむ前に脱気している人がいます。 私はしていなかったのですが、脱気したほうがいいのでしょうか？ 同じ細胞からlysateのサンプルを作っている人がいないので、うまくいかなくても何が悪いのかわからず途方にくれていました…。

(無題) 削除/引用 No.4203-13 - 2007/05/13 (日) 14:24:26 - おお >[Re:11] blotさんは書きました : > > 当方が170mAでtransferするとするなら、20分〜２５分が妥当で、transferには十分だと思います。 > > 170mAで1時間という条件だと、さすがに、抜けてしまう可能性が高いと思います。 >[Re:9] あやさんは書きました : > > メンブレンへの転写は > 水槽式：50Vで３時間 > 　　　　バッファーは40mM Tris、150mMグリシン、20%メタノールです。 > semi-dry：170mAで１時間 > 　　　　　バッファーは３種類を使う転写効率がいいという方法でやってみ　　　　　ました。 > 　　　　　300mM Tris,20%メタノール　pH9.6 > 　　　　　25mM Tris,20&メタノール pH10.2 > 　　　　　25mM Tris,40mM CAPS,20% メタノール pH9.4 > さらに各バッファーには0.1% SDS,2M　Ureaも含まれています。 小さい分子は確かにぬけやすいですから、可能性がありますね。少し注意が必要なのは場合によってちがいます。私の場合はこの条件で20kDaあたり抜けたりしません。SDSを入れていないからだと思います。周りのひとがやっていてその条件でうまくいっているようだったらそのままいじらないでも良いと思います。 > > 小さいタンパクの部分しかブロッティングしていないのですが、westernで検出しても非特異のバンドさえでない状況です。 >[Re:5] あやさんは書きました : > CBB染色で大きなタンパクのバンドはあるのに、小さいタンパクのバンドがほとんどないって、ふつはないですよね？ > 小さいタンパクだけ抽出できてないとかあるんでしょうか？ > Lysis bufferで溶解するだけの作業だと小さいものだけ抽出しにくいということはまずないと思います 20KDaということですが、参考になるかどうか、、、マンマリアンのlysatesの染色パターンを拾っておきました。40k-60kの領域に比べ20KDaあたりはタンパク量は少なそうです。 http://roche-biochem.jp/catalog/index.php?product=3.2.7.1.44.2 ウェスタンでインターナルコントロールとかほかのたんぱく質を検出できるでしょうか。SDSPAGEじしんがうまくいっていなかった場合、バンドが乱れてきますので、検出感度がかなり落ちることがあります。トランスファーに問題があると考えにくい場合はやはりSDSPAGEかまたは検出に問題があるかもしれません。何かポジコンがあるでしょうか?それとだれかちゃんとワークしたlysatesをもってないでしょうか。あと、どうも原因がはっきり分からないけど変だという時は、バッファーとか作り直してみましょう。何か勘違いということもあるでしょうから。 ちょっと多面的な角度で見た方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4203-12 - 2007/05/13 (日) 14:21:01 - きまぐれ 既に書かれている方もいらっしゃいますが、 マーカーの低分子量バンドはクリアに見えていますでしょうか。 泳動バッファは共用ですか？　 pHの下がったバッファで泳動したときに（なぜ下がったかは追究しておりません） 40kD以下のバンドが薄くなった経験があります。 試料の展開中にサンプルバッファに加えたBPBの色が青色から緑色に変わり、 プレステインマーカは低分子が不鮮明になりました。 マーカーバンドは1本ずつが多量の蛋白でできていますので、 半分以上分解しても残りが見えていたのだろうと思います。 泳動バッファを作り直して解決しました。

(無題) 削除/引用 No.4203-11 - 2007/05/13 (日) 12:07:55 - blot すみません。 transferの条件は人それぞれだと思いますので、私感という事でかきます。 170mAで1時間という条件は、20kDa程度のtransferにはきつすぎると思います。 当方が170mAでtransferするとするなら、20分〜２５分が妥当で、transferには十分だと思います。 170mAで1時間という条件だと、さすがに、抜けてしまう可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4203-10 - 2007/05/13 (日) 11:59:04 - TS 小さい分子量のマーカーはうまく流れてるのでしょうか？ たとえ流れているとしても、サンプルがきちんと流れていないことを疑うのが先決のような気が私はします。 わたしなら、ラボの他の人にゲルを作ってもらって流してみますが（電気泳動まで任せるのがより良いでしょう）。 系がうまく行っている人に頼むのがよいと思います。 ゲルのCBBでうまく染まっていないので、十中八九、電気泳動に問題があると思います、私は。

通りすがりさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.4203-9 - 2007/05/13 (日) 00:51:10 - あや 条件を書いてみます。 電気泳動は、15%のゲルで行っています。泳動槽のバッファーの組成は今すぐはわからないのですが…。 30mA/gelで泳動しています。 メンブレンへの転写は 水槽式：50Vで３時間 　　　　バッファーは40mM Tris、150mMグリシン、20%メタノールです。 semi-dry：170mAで１時間 　　　　　バッファーは３種類を使う転写効率がいいという方法でやってみ　　　　　ました。 　　　　　300mM Tris,20%メタノール　pH9.6 　　　　　25mM Tris,20&メタノール pH10.2 　　　　　25mM Tris,40mM CAPS,20% メタノール pH9.4 さらに各バッファーには0.1% SDS,2M　Ureaも含まれています。 同じサンプルでゲルを２枚電気泳動し、１枚をＣＢＢ染色、１枚をブロッティングしています。 分子量の小さいタンパクはＣＢＢ染色の段階でもバンドは薄く少ししかみえません。 小さいタンパクの部分しかブロッティングしていないのですが、westernで検出しても非特異のバンドさえでない状況です。

(無題) 削除/引用 No.4203-8 - 2007/05/12 (土) 18:55:02 - 通りすがり 原因の可能性のありそうな電気泳動や転写の条件　ゲル濃度・電流・電圧・時間・バッファー組成（メタノール濃度等）を書けば、 具体的なアドバイスをもらえるかもしれません。 最初は転写時に小さいタンパクがメンブレンを通り抜けた可能性が高いと思ったのですが、 ゲルをCBB染色した段階ですでにバンドが見えないとなると、電気泳動に問題がありそうですね。 役に立たないレスですみません。

TSさんありがとうございます。 削除/引用 No.4203-7 - 2007/05/12 (土) 17:30:20 - あや きちんと書かなくてすみません。 CBB染色はしています。それで、大きいタンパクのバンドは確認できたのですが、40kDa以下のバンドがほとんど見えなかった、ということです。 やっぱり、泳動か、転写が問題なんですかね？ ところで、パンスーってなんですか？知識不足ですみません。調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.4203-6 - 2007/05/12 (土) 15:01:13 - TS 転写後のメンブレン、パンスーしてますか？ それでタンパク質があれば、抗体の問題ではないですか？ それと、いまいち明確な文章が見あたらないのですが、電気泳動後のゲルをCBBで染めたんでしょうか？ 電気泳動、転写のどちらかに問題があるような気がしますが。 サンプル調製は大丈夫でしょう。

blotさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.4203-5 - 2007/05/12 (土) 14:53:42 - あや CBB染色で大きなタンパクのバンドはあるのに、小さいタンパクのバンドがほとんどないって、ふつはないですよね？ 小さいタンパクだけ抽出できてないとかあるんでしょうか？ blottingは水槽式のものとsmi-dryのものと２種類でやってみました。 CBB染色で見えていた大きなバンドの部分はblottingしていませんが、どちらでも結果は同じで非特異のバンドさえ検出できませんでした。 blottingに使うバッファーは研究室で共用しているのですが、ほかの人は特におかしいところはないと言っているので、blottingのバッファーが間違っているわけでもなさそうです…。 TCAで抽出する方法があるんですね？ 知らなかったのでちょっと調べてみます。

おおさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.4203-4 - 2007/05/12 (土) 14:35:15 - あや サンプルバッファーはSDSもbeta-MEも入っています。冷蔵庫で保存しており、研究室のほかの人たちと共有しているのですが、だれもおかしいとは言っていないのでたぶんサンプルバッファーは大丈夫そうです。マーカーの泳動も普通でした。 泳動は大丈夫かな、と思うのですが…。

(無題) 削除/引用 No.4203-3 - 2007/05/12 (土) 07:40:25 - blot lysis bufferは、おかしく無いと思いますが、使える物かどうかの判断は、今のままでは出来ないと思います。 確かめるには、全く別の方法で抽出し、それ以外を全く同じ物を使ってやってみるしかありません。例えば、TCA位なら大抵のお部屋にはあるかもしれませんし高く無く、抽出の手間も少ないので、bufferの確認と言う目的には、良いかもしれません。 20kdaのタンパクは、私も見ていますが、バンドは明確です。そのへんのバンドは、沢山あるはずですので、非特異も無いと言うのが気になります。 bufferの問題と言うより、blottingの条件は大丈夫ですか？大きなタンパクはあるのに、小さい物が消し去ったように無いと言うのは、抜けてるんじゃないかとも思えなくもありませんし。

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