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(無題) 削除/引用 No.4202-9 - 2007/05/24 (木) 17:21:28 - かわさき http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ACTB&search=beta+actin や http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?position=chr7:5533313-5536747&hgsid=92738899&refGene=pack&hgFind.matches=NM_001101, あたりがよろしいかと。beta actinのGene symbolはACTBなので、それで調べたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4202-8 - 2007/05/22 (火) 11:19:27 - ひろ DNAのコンタミが考えられるのであれば、mRNAをとるか、もしくはGAPDHはイントロンとエキソンが存在しますので、プライマーを作る段階で、プライマーをイントロンとエキソンのjunction部分に設計して、ゲノムDNAを引っ掛けないようにしたらどうですか？？

(無題) 削除/引用 No.4202-7 - 2007/05/22 (火) 10:27:35 - とりぞー 御返事ありがとうございます。 よく理解できていないのでお聞きしています。 β‐アクチンのほうがＧＡＰＤＨよりも内因性コントロールとしては優れているという話を聞いたことがありますが、そうなのでしょうか？ 既製品のＢ‐アクチンのプライマーは高いので自分で作成しようと思ってますが、ＧＥＮ−ＢＡＮＫでβーアクチンの塩基配列を検索できなかったのですが、どなたかマウス、人、ラットのβ‐アクチンのプライマーの塩基配列が掲載されている文献があれば教えていただきたいのですが。 また的外れな質問であれば失礼します

(無題) 削除/引用 No.4202-6 - 2007/05/13 (日) 11:54:33 - そば すいません。 そういうつもりではなかったのですが、反省しておきます。

(無題) 削除/引用 No.4202-5 - 2007/05/13 (日) 11:24:41 - とても野次馬ですが そば さんってストレスたまってるんですか？ 他の質問にも直接的な回答ではない内容を続けて書かれていますが、建設的な回答が無い場合は黙っていても良いんですよ？

(無題) 削除/引用 No.4202-4 - 2007/05/12 (土) 22:02:16 - そば 基本的に他の方が指摘されている通りだと思うのですが。 個人的に思いますに、そのような質問はこのようなフォーラムで書き込むよりも、実際のデータを見ながら話す方が有用な情報が得られるものではないかと思います。 （例えば、バンドの濃さがばらばらになると言っても、実際にデータを見ないと、それが許容される範囲のばらつきなのかどうかを判断することは出来ません） もし近くに、同じようなサンプルを用いてRNAを回収してGAPDHが揃う方がいるのであれば、まずはその方に実験データを見せて相談する方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4202-3 - 2007/05/12 (土) 09:20:00 - gene DNAのコンタミが原因と考られる要因がありますか？　例えば逆転写なしでもPCR産物が生じるとか。DNase処理を考えるのはそれを確かめてからで良いと思います。 ロットの違うRNAサンプルでは逆転写効率が振れるのは普通で、これがartifactとなります。吸光度でRNA量を、誤差や干渉の影響なく、正確にそろえられたとしてもも、夾雑の度合い、RNAのintactさによって1st strandの収量は変わりえます（DNAを鋳型にするDNA polymeraseはそれほどの振れは起こりにくい）。 そういうことがあるからinternal controlをとって補正するのですね（逆に、そういうことがなければ、吸光度でそろえて目的の産物だけ比較すれば良いわけで）。バンドの濃さで比較するような半定量の場合は、RNAサンプルの量を振って、同じ強度になるような条件を決めてから比較するのがいいでしょう（つまり吸光度で測ったRNA量ではなく、コントロールの強度が一定になる「当量」を基準にする）。 コピー数が求められるような実験系なら、internal controlが振れても、そのコピーあたりで、目的の産物のコピー数を補正するという考え方もできます。しかし、コントロールが一桁も振れるようだと反応のlinearityが怪しいので、やっぱりある程度、投入する量を調整したほうが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.4202-2 - 2007/05/12 (土) 07:47:46 - blot ＞ハウスキーピング（ＧＥＰＤＨ）のバンドの濃さがばらばらになってしまいます。 良く理解出来ていないので、書き込むのはどうかと思いますけど。 バンドの濃さがバラバラなのは、別に不自然では無いと思います。半定量でRNAの発現見る際も、ハウスキーピングの発現量で補正をかけ、鋳型量をあわせてから行いますよね？ 絶対定量の際も、それぞれのsampleのハウスキーピングの量が同じって事は、ありえないとおもいます。 単に、光吸度で量をあわせたって言う事と、ハウスキーピングの量を一定にしたという事とは、別問題駄と思います。何をするのかにもよりますが、正直、意味が無いと思います。

ＲＮＡ抽出からＲＴ−ＰＣＲの際のＤＮａｓｅ処理 削除/引用 No.4202-1 - 2007/05/11 (金) 21:22:48 - とりぞー トリゾール法にてマウス組織などからＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲを行っていますが ＲＮＡの定量を吸光度から測定し同じ量ＲＴしているはずなのですがＰＣＲを行うとハウスキーピング（ＧＥＰＤＨ）のバンドの濃さがばらばらになってしまいます。ＤＮＡのコンタミなどが問題になっているのかと思いＤＮａｓｅ処理しようかと考えていますがＤＮａｓｅを加えるのはＲＮＡ抽出時がよいのでしょうか、それとも抽出後のＲＴの前に加えるのがよいのでしょうか、 またＤＮaseの不活かはEDTAをくわえるのでよいのでしょうか？それともDNA抽出キットのカラムなどに通したほうがよいのでしょうか？教えてください。 それともハウスキーピングのバンドが一定にならないのは何か他の問題があるのでしょうか？初心者なのでしょうもない質問ですが教えてください。

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