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(無題) 削除/引用 No.4189-10 - 2007/05/10 (木) 21:06:02 - カナマイシン 追伸ですが、凍結＆再融解しても SDSの析出に関しては問題がなかった気がします。 まあ、よく上下しないと均一にならないので、 こと還元剤に関しては影響はわかりませんが。 少なくとも泳動はできました。

(無題) 削除/引用 No.4189-9 - 2007/05/10 (木) 21:03:51 - カナマイシン gene様 失礼しました。 後で補足しようと思ってたのですが、 もちろんいい加減に保存することを 推奨するつもりはありませんでした。 「泳動バッファーの役割は果たせる」が、実験の重要さ次第では もちろんしっかりやるべきです（←言い訳がましい）。 私は素性がしっかりわかっている蛋白（S-Sの有無、分子量、その他）の 精製チェックで「いい加減バッファー」を使ってます（言い訳がましい）。 誤解を与えて申し訳ありませんでした、 ＆gene様、ありがとうございました。 P.S. S-SがSDSや煮沸で切れないことは本当に知りませんでした・・・

感激です 削除/引用 No.4189-8 - 2007/05/10 (木) 19:52:54 - mika 何度も質問に答えていただいてありがとうございます。 試薬ひとつでもいろいろな知識が必要だと感じました。還元剤の保存状態で結果が違ってくることは怖いですね。試薬の管理をもっと慎重にやろうと思いました。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4189-7 - 2007/05/10 (木) 19:38:43 - gene ＞私のラボのサンプルバッファーは既にDTT入りで小分けにして凍結されているのですが、 凍結してあるのなら、かなり長期間保存しても（たぶん年の単位で）大丈夫だと思います。 ただ、スジ論をいうと、やはり希釈した状態だと何であろうと酸化しやすくなります。SDSが入ったものを凍結すると析出して、それを再溶解するのに余計な時間がかかりそうですし、、、 ＞この場合だとDTT抜きのサンプルバッファーは室温保存でも大丈夫ですよね？ です。そうしています。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.4189-6 - 2007/05/10 (木) 18:26:42 - mika geneさん詳しい説明ありがとうございました。勉強になりました。 確かにこれまではSS結合のない標的をみてきたので影響が無かったのだと分かりました。ところで私のラボのサンプルバッファーは既にDTT入りで小分けにして凍結されているのですが、1M DTTの凍結ストックを毎回溶かしてからサンプルバッファーに添加した方がいいのでしょうか？（この場合だとDTT抜きのサンプルバッファーは室温保存でも大丈夫ですよね？）どちらの場合もDTTは凍結保存されているわけだから添加済みのサンプルバッファーでも問題ないと思ったのですが間違いでしょうか？サンプルバッファーに入った状態のDTTだと不安定だとか、あるいは高濃度の方が安定だから別にストックしておくのか、そういった理由なのでしょうか？それと凍結融解を繰り返すのも良くないと感じているので３回くらいまでにしていますが正しいのかはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.4189-5 - 2007/05/10 (木) 15:54:19 - gene 2-MEにしてもDTTにしても還元剤（つまり自らは酸化されやすい）ですから、空気中に放置すれば酸化されて、かなり急速に還元力を失っていきます。 言うまでもなく、還元剤の役割は、高次構造や多量体化の原因となるdisulfide bondを還元して切断することです。その目的、原理を考えれば、酸化しやすい状態で、長期間おくのが好ましくないことは言わずもがなですね。 還元剤抜きでストックしておいて、使用直前に還元剤を加えるべきです。あらかじめ加えておいたところで、たいして手間が省けるわけでもなし。また、2-MEはすぐに使い切れない量で包装されているので、開封後どんどん酸化されていきます。代わりに1 M DTT水溶液を小分けして-20℃で保存したものを使う方が良いと思います。 disulfide bondも共有結合ですから、 ＞そもそもSDSと煮沸で切れてしまうハズなので、 これはないと思います。 長期保存したものでも大丈夫だったというのは、いままで相手にしていたタンパク質がたまたまdisulfide bondを持っていなかったからじゃないでしょうか？ ものによっては、還元剤の効き具合（量や新鮮さなどによる）で泳動像に大きなインパクトがあります。

(無題) 削除/引用 No.4189-4 - 2007/05/10 (木) 15:22:39 - mika 皆様早速ありがとうございました。 DTTについて別のトピックスでも活性の話が出ていたので少し不安だったのですが問題なさそうなのでホッとしました。

(無題) 削除/引用 No.4189-3 - 2007/05/10 (木) 15:06:07 - カナマイシン うちのラボは限りなくテキトウです。怒られるかな・・・ 4 度や常温で置いてます。 2-MEやDTTは（主に）S-S結合切断のために入れますが、 そもそもSDSと煮沸で切れてしまうハズなので、 普段はあまり気にしてません。 もちろん、そこに気を使うべき実験の場合は作り直すでしょうが。 今のところ遭遇してないです。 ちなみにDTT派です。

(無題) 削除/引用 No.4189-2 - 2007/05/10 (木) 14:55:07 - ... DTTではなく2-MEを使っているので参考程度なのですが、うちのラボでは2-MEを除いたSDS-sample bufferを常温で保存し、使用直前に2-MEを加えて使っています。かなりアバウトですが2-MEを加えたものは2週間以内くらいには使い切るようにしていますが特に問題はないです。

サンプルバッファー保存期間 削除/引用 No.4189-1 - 2007/05/10 (木) 14:24:52 - mika SDSサンプルバッファーのことで、昔聞いた話では、2MEの活性が落ちるので作り置きはできないということでした。現在のラボではDTT入りのサンプルバッファーを冷凍保存しているのですが、どれくらい持つのでしょうか？半年前に作ったものをつかっても今のところ問題はないのですが念のためご意見お聞かせ戴ければ嬉しいです。

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