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(無題) 削除/引用 No.4177-5 - 2007/05/09 (水) 21:17:34 - 〜 十分量とはどの位の量でしょうか。 薄くても見えているのでしたら、クローニングは出来ますよね。 クローニングしてからベクターから切り出したほうが、 変異を気にせずに使えると思いますが、 PCRで増やして直接何かに使いたいのでしょうか。 テンプレート無しのPCR mixを作って、 泳動したバンドをチップでつついて、 そのチップをPCR mixで洗って反応させてみてはいかがでしょうか。 (つんつんPCR) http://www.biology.tohoku.ac.jp/lab-www/cellbiol/kojinn/oba/1cell.html

(無題) 削除/引用 No.4177-4 - 2007/05/09 (水) 14:11:50 - かめ 8キロで8分も伸ばさなくても大丈夫ですよ。 1−2分短くしたら、taqのへたりが減るおかげで 結果的に産物が増えるかも。 また、dNTP濃度が低い方が、イオン強度の関係でプライマーの非特異アニールが減って、効率が上がる事がある というようなことがタカラの何かのTaqのQandA に書いてありますが、実際減らした方がきれいに増えたことがあるので、 dNTP濃度を振るのは試す価値があると思っています。 もちろん期待量に必要なだけのdNTP絶対量は無くてはなりませんが。 プライマーの非特異アニールを減らすという意味では、アニール温度も下げるより上げた方がいいこともあります。

(無題) 削除/引用 No.4177-3 - 2007/05/09 (水) 12:58:05 - おお 通りすがり さんの言うようにたいてい細かいところを変えてもたいていの場合ほとんど変わらないというのが印象です。まDMSOは入っていてもじゃまはしない事がたいていで、まれに意外と効果を示すことがあるので、ま、加えといたらというきがします。 私が進めるPCRの改善法の一つはプライマーをかえるということです。目的にもよりますが、もうワンセット持っていれば4通りの組み合わせができますし、ネストもかけられますから。 もう一つは違う会社の酵素を使うということです。これは酵素の特性もありますが、各社PCRのバッファーなどに工夫がされているでしょうから、バッファー条件を変えているようなものかなと思うからです。ちなみに私はタカラのピロベストをよく私は使います。 酵素がへたるのも可能性がありますが、8kでもしっかりと出る時はでます。気になるならばディネーチャーの時間を5sぐらいと短くするのもいいかもしれません。 あとは細かいところは変えてもといってもといいながら細かいことですが、テンプレートの量が多すぎてかかりにくいという事があります。テンプレートが多いほうがいいだろうと思う人もおおくて、結構必要以上に入れている人もいます。あとはタッチダウンをやる人がいますね。これも選択肢の一つだと思います。 あとはゲノムの質もチェックした方がいいかもしれませんね。0.8%ぐらいのアガロースでながして、50kbより上に来るぐらいの大きさは確保した方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4177-2 - 2007/05/09 (水) 12:16:33 - 通りすがり 増幅された産物の量が少ない場合の対処法としては 条件設定などが最適化されてないのや,templateの2次構造など もちろんいろんな要因があるのですが、 細かいとこ変えたりDMSOとか加えてもはっきりいって大して変わらんです。 一番劇的に変わることが多いのはdNTPと酵素の量を 増やしたり途中でPCRを一回とめて添加し直すことです。 要するに長い産物をなってくると基質のdNTPが足りなくなってきてきたり いくら酵素が熱耐性でも長時間の反応では失活は有る程度おきてしまうため という単純なとこが原因であることが多いです。

LA PCRによって目的断片を十分量増幅させる方法 削除/引用 No.4177-1 - 2007/05/09 (水) 11:31:58 - TN 現在ショウジョウバゲノムを鋳型として、約8kbの断片をLA PCRによって増やす実験を行っています。 PCR産物を電気泳動で確認した結果、目的の位置に特異的なバンドは出たのですが、なぜかとても薄いものでした。 アニーリング→伸長反応（8分間）は30サイクル行っていますし、PCRに用いる鋳型DNAの量を増やしたり、アニーリングの温度を下げるなどやってみたのですが、結果に変化は見られません。 どうして十分な量の断片が増幅されないのでしょうか？ また、どうすればこの問題を解決することが出来るのでしょうか？ ご存じの方、アイデアをお持ちの方がいらっしゃいましたら、ご教授のほどよろしくお願い致します。

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