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生えました 削除/引用 No.4171-8 - 2007/05/10 (木) 00:10:23 - niko お返事ありがとうございます。 そうでした、pCRーTOPOは発現ベクターではないです。確認後、発現ベクターに移し変えます。 シークエンスを全部確認するかつなぎ目だけを確認するかは人それぞれなのですね。 ライブラリーから得られたものであれば、つなぎ目の確認でも大丈夫かもしれないのですね。PCRで得られたものならばどこかに記載があるのでしょうか。 Open Biosystemsから購入しました。 室温で送られてくるものなのですね。 その後はー80Cで保存できるのですか。 先程プレートを見たらコロニーは生えていましたが、昔にストリークした時のことを考えると思ったより少なかったです。 拾えればいいのですけどね。。。

(無題) 削除/引用 No.4171-7 - 2007/05/09 (水) 21:10:30 - 〜 >それからやはり４ｋｂすべてsequenceを確認した方がいいのですよね？ 私ならば全部読みます。 期待と違う結果が出たときに、 「もしかしたら変異が入っているかも」 などと考えるのが嫌だからです。

(無題) 削除/引用 No.4171-6 - 2007/05/09 (水) 15:48:35 - Ｔ pCR4-TOPO は動物細胞用の発現ベクターではないですが、その点は大丈夫でしょうか？ transfection と書いてあったのでちょっと気になりました。

(無題) 削除/引用 No.4171-5 - 2007/05/09 (水) 15:16:35 - 奴隷 Open Biosystems社ならば、cDNAクローンで形質転換された大腸菌の培養液（含グリセロール）の形で室温で送られてきます。ストックとしては、それを（よく懸濁した後に）-80℃に保存しろという意味だと思います。 それから、ライブラリーの作製方法がPCRをくぐっていないなら、全長シークエンスする必要はないと私は思います。多数のクローンを扱っているので、cDNAの両端はシークエンスして確認しておいた方が良いでしょうが。

調べたりませんでした 削除/引用 No.4171-4 - 2007/05/09 (水) 14:54:53 - niko お返事ありがとうございます。 実はこのことに遭遇したのは隣人の初心者で、2人でどうしたものかと考えていたところです。　最初の情報は本人が言っていたことなのですが、自身でも調べてみました。 遺伝子のデータベースから、発現ベクター（ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ）に挿入されたいるｃＤＮＡクローンがあることがわかり、脇にそのI.M.A.G.E clone(M.G.C. clone)を購入できる代理店が5つ記載されてありました。　こちらのラボでは注文はすべて秘書に依頼するシステムになっており、彼は馴染みのあるＩ社のものを注文したようです。　先ほど調べてみたところ、他の２社のものは見つけたものと同じ発現ベクターに入ったクローンだったのですが、Ｉ社のものはESTのlibraryでした。　これはそのlibraryから得られたものということなのでしょうかね。　しかもクローンseqは約４ｋｂ（ｍＲＮＡが１０ｋｂでした）でした。　よく調べる前に投稿してしまったことをお許しください。　幸い間違って購入した（？）libraryは他に欲しい人がいたのでそのまま使われ、欲しいcloneを再度購入することができたのですが（しかも安かったです＄７５)、４ｋｂであれば、自分で単離するのも普通でしょうか。　でもこの値段なら買ったほうが安上がりかもしれないですね。 しかし、欲しいものを購入できたのは良かったのですが、これが、室温で送られてきました。。。　バイアルの入った容器にはStore at −80Ｃとあり、液状になっていたのでグリセロールストックだと思います（Agarではないです）。　同じラボの他の人は、まあたぶん大丈夫だと言うのですが、確かに最終的にコロニーが拾えればいいのかもしれませんが、弱った菌体から得てその後の実験には支障はないでしょうか。　もちろんコロニーが生えなければクレームするつもりですが。 それからやはり４ｋｂすべてsequenceを確認した方がいいのですよね？

(無題) 削除/引用 No.4171-3 - 2007/05/08 (火) 16:44:44 - 〜 優先順位としては、 １、買ったものが何なのか、使えないのならば返品できるかをすぐに調べる ２、使えないものだった場合、必要なベクターをどのようにして手に入れるかを調べる の順番でしょうか。 >その番号を元に注文しました。 それはメーカーのデータベースでしょうか。 そうであれば、メーカーに文句を言えます。 違うのであれば、メーカーの型番を確認せずに買ったのでしょうがないですね。 どこかにメーカー名や商品名を記録に残る形で(メールや紙などに)書いて注文しているのであれば、 代理店さんに返品の交渉をしてみてはいかがでしょうか。 >あらゆる遺伝子が含まれているヒトcDNA cloneで cDNAライブラリーを購入したのでしょうか。 もしかして、このライブラリーから遺伝子を取得したという論文を見ていたのではないですか？ >非常に高価なのでどうするべきかと。。。 単一のクローンでしたら数万円くらいで買えませんか？ ライブラリーに比べれば一桁は安いと思います。 自分で試薬を買って、プライマーも買って、材料からmRNAを精製して、クローニングするコストを考えれば、 買ったほうが安上がりだと思います。 10kbの遺伝子をクローニングするのは大変だと思います。 PCRがうまくいかずに数ヶ月以上かかるかもしれませんので、 実験を進めたいのでしたら、買うことをお勧めします。 実験の基礎を学びたいというのならば、 自分でクローニングしてみるのも勉強になりますが、 目的の実験はその間止まってしまいます。 >普通はどのように遺伝子を単離するのでしょうか。 貰うか、買うか、クローニングするかの三択だと思います。 どれが普通なのかは、材料がどれくらい広く使われている生物なのか、ラボの方針、台所事情などによります。 貰う： 実際に使っている人から貰えるのであれば、それが一番楽です。 謝辞に書くか、一人か二人著者に載せるだけで、 使いたいベクターを使うことができます。 たまに違うベクターや変異入りの物を送ってくる人がいますので、 一通りシーケンスしておいたほうがいいと思います。 (変異入りの発現ベクターを貰うとして、2回連続で変異の入ってないベクターが送られてきたことがあります) 買う： 金さえあれば、楽です。 ただ、中の配列がおかしいものが入っていることがありますので、 一通りシーケンスする必要があります。 自分でクローニング： 慣れていて、試薬がそろっていれば、買うよりも安上がりに手に入ります。

(無題) 削除/引用 No.4171-2 - 2007/05/08 (火) 16:39:30 - 奴隷 メーカー名、製品番号等が伏せられているので詳細は分かりませんが、「その番号」というのが「当該遺伝子のcDNAが発現プラスミドにクローニングされたものの製品番号」に間違いがないのであれば、メーカーか代理店のミスですので、その旨を指摘して代替品を要求できます。 もし、貴方が「cDNAライブラリーの製品番号」で誤って発注したとしたら、そこからクローニングできるかもしれませんが、そのためにはそのライブラリーに当該クローンが含まれていることが前提となります。 メーカーのHPから検索して他社のHPに飛ぶということですが、最初の「メーカー」というのは単なる国内代理店ではないですか？ いずれにしても、10kbのcDNAを単離しようとするなら、かなりの手間を覚悟しておいた方が良いと思われます。 普通はどのように遺伝子を単離するかとのことですが、挙げておられる全長cDNAクローンを購入する他、論文の原著者にcDNAを請求する、手持ちのライブラリーからcDNAクローンをスクリーニングする、短いcDNAならばPCRで全長を得る、等の方法が考えられます。

Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎするクローン 削除/引用 No.4171-1 - 2007/05/08 (火) 14:06:41 - niko 実験初心者で、初歩的な質問で恐縮です。 このたび、ある遺伝子のタンパクの発現を見ようとしています。Data baseから、既に全長のcDNA(約10kb)が発現ベクターに組み込まれたものが売られており、その番号を元に注文しました。　ところが、届いたのは別のメーカーからのあらゆる遺伝子が含まれているヒトcDNA cloneで発現ベクターではなく、それで良いものか困惑しています。　これからＰＣＲ等で目的遺伝子をとるのでしょうか。　Ｉというメーカーのホームページから検索すると、結局Ｃというメーカーに行くので、Ｉ会社を通して買うようになっているようなのですが、自分の欲しい遺伝子が本当に含まれているのか情報がありません。　これは、含まれていると思っていいのでしょうか。　他にも購入可能な会社はあるのですが、買いなおすべきなのか、非常に高価なのでどうするべきかと。。。 また、ある遺伝子をTransfectionし、タンパクの発現を見ようとする場合、普通はどのように遺伝子を単離するのでしょうか。　全長cDNAのクローンを購入するのが一般的なのでしょうか。

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