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マウス脳パラフィン切片作成について トピック削除
No.4148-TOPIC - 2007/05/02 (水) 22:04:33 - icyee
マウスの脳のパラフィン切片をつくるところで苦労しています。下記の方法で大人のマウスの脳をパラフィンで包埋し、８um切片を作ってみたところ、
１．切片にはしわがあり、
２．切片がでこぼこで波打っていて
３．側脳室の形状がぼろぼろ
という状態になっていました。組織の周りのパラフィンは、きちんと伸展できてたのですが、組織は周りのパラフィンに邪魔されてか、しわがある状態で、綺麗に伸展できませんでした。どうしてでしょうか？組織がパラフィンに比べて固すぎるから切片が波打つのでしょうか？それとも包埋の方法に問題があるのでしょうか？

方法
４％PFA灌流固定、その後1晩４Cで固定
７０％EtOH　１時間　室温
１００％EtOH　1時間　室温
１００％EtOH　1時間　室温
キシレン　1時間　室温
キシレン　1時間　室温
パラフィン　1時間　６５C
パラフィン　1時間　６５C
パラフィン　1時間　６５C

どうぞ宜しくお願いします。
　
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ラットの皮膚の脱水について 削除/引用
No.4148-5 - 2007/05/07 (月) 16:17:21 - angeljuan
ラットの皮膚の組織を脱水したいですが、自動脱水器はほかの人の予定がいっぱい入っていましたから、手動で脱水したいと思います。最後のパラフィン浸透は3回を行いたいですが、それぞれどの時間が設定したほうがいいでしょうか？何卒宜しくお願い申し上げます。

留学生のコウより

パラフィンの浸透時間が不十分では 削除/引用
No.4148-4 - 2007/05/07 (月) 16:03:47 - 千
脱水・透徹・パラフィン浸漬各段階全てにおいて、時間が短すぎるように思います。
私のラボでは

　固定(icyeeさんと同様です)
　70%エタノール　数時間〜数日以上(この段階で保存することもあるので)
　100%エタノール　１時間程度×２回
　100%エタノール　over night
　キシレン　１時間×３回
　パラフィン@　数時間
　パラフィンA　over night
きれいなパラフィンで包埋

このようにしています。エタノールとキシレンは室温です。
一応、いつも良好なパラフィンブロックが得られています。
脱水のエタノールの濃度ですが、自動固定包埋装置などでは、100%エタノール（３〜４槽）のみ、というところが多いです。なので、70%エタノールも省略できなくはないと思いますが、浸透なしで、手動での作業でしたら、入れたほうがいいと思います。
後は、薄切のときにブロックを程よく冷し、切りにくい切片の場合は、軽く息を吹きかけるか、ぬらした厚紙(私はこれに切片をつけて水に移してます)を組織面に触れさせ、組織にやや湿り気を帯びさせると、きれいに切れます。
ご参考になれば幸いです。

追加で 削除/引用
No.4148-3 - 2007/05/06 (日) 21:00:28 - さらに
50%アルコール/50%キシレンを入れるとなお良いかと。
パラフィンも温度を可能な限り下げる(60℃程度)のも効果があると思われます。
中間剤もキシレンよりトルエンさらには安息香酸メチルなんかの方がサンプルの収縮は少ないです。
近くに組織学のラボがあればそこの自動包埋装置を利用させてもらうのが一番手っ取り早いですけどね。

脱水が 削除/引用
No.4148-2 - 2007/05/02 (水) 22:17:08 - 包埋
不十分なのではないでしょうか？

少なくとも７０％→８０％→９０％→１００％

の段階はいると思います。あとは、よく攪拌して、しっかり脱水してください。

これに９５％を加えてるとより良いかと・・・

組織の硬さより、脱水不良によってパラフィンの浸透が悪いからの気がします。

マウス脳パラフィン切片作成について 削除/引用
No.4148-1 - 2007/05/02 (水) 22:04:33 - icyee
マウスの脳のパラフィン切片をつくるところで苦労しています。下記の方法で大人のマウスの脳をパラフィンで包埋し、８um切片を作ってみたところ、
１．切片にはしわがあり、
２．切片がでこぼこで波打っていて
３．側脳室の形状がぼろぼろ
という状態になっていました。組織の周りのパラフィンは、きちんと伸展できてたのですが、組織は周りのパラフィンに邪魔されてか、しわがある状態で、綺麗に伸展できませんでした。どうしてでしょうか？組織がパラフィンに比べて固すぎるから切片が波打つのでしょうか？それとも包埋の方法に問題があるのでしょうか？

方法
４％PFA灌流固定、その後1晩４Cで固定
７０％EtOH　１時間　室温
１００％EtOH　1時間　室温
１００％EtOH　1時間　室温
キシレン　1時間　室温
キシレン　1時間　室温
パラフィン　1時間　６５C
パラフィン　1時間　６５C
パラフィン　1時間　６５C

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