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(無題) 削除/引用 No.4147-5 - 2007/05/11 (金) 09:55:37 - gene >これらの実験においてRNAをcDNAに変換してからPolymeraseでPCRを行う方法と、 >RNAから直接逆転写とPCRを行う方法がありますが、どちらの方法がより、鋳型のmRNA量を正確に定量できるのでしょうか？ これは、2 段階で反応するか、いわゆるone tube反応をするかの違いだけで、one tube反応でもmRNAから直接PCRをかけているわけではなく、どちらも逆転写反応をするわけですよね。RT-PCRでは、逆転写の効率がサンプルごとに振れるのがかなり大きなartifactになるので、この点に関してはどちらの方法も同じ問題を内在しています。 私見ですが、PCRでmRNAの定量をする場合、もっとも信頼できるのは、逆転写の段階から既知量のmock RNAをサンプルRNAに加えておこなうcompetitive PCRだと思います。mockもサンプルも同等の逆転写効率だと見なせますので。 また、oligo-dT primerやgene-specific primerよりrandom primerのほうがサンプルごと、あるいはRNA種ごとの逆転写効率効率の差が出にくいです。 PCRにこだわらないなら、RNase protection assayが優れていると思います。

(無題) 削除/引用 No.4147-4 - 2007/05/11 (金) 09:34:06 - 通りすがり TSAとかAzaC使う実験でactinってコントロールで かなり多く使われてるはずですが... そんなに影響でるもんでしょうか？ まあ使う濃度や細胞の種類によって違うのかもしれません。 β-actin 以外の影響を受けないコントロールなどを(rRNAやGAPDHなど) をいくつか試してみて、一番影響の少ないコントロールを 探すしかないでしょうね。 基本的にRNAの定量実験では複数のコントロール用のprimerやprobeなどを準備しておいてプレ実験みたいな段階でそれぞれの実験系で影響の少ないコントロールを用意しておくべきですね。

同じく、mRNAの定量に困っています 削除/引用 No.4147-3 - 2007/05/11 (金) 09:16:53 - Mr.Fr. ﾘｱﾙﾀｲﾑPCRで、ｺﾝﾄﾛｰﾙとして、β-actin を使っているのですが、 サンプルが遺伝子全般一律に転写活性を上げる薬剤（ex.5-AzaやTSA）したもので、処理効果がβ-actinにまで影響してしまうみたいです。 補正してﾃﾞｰﾀを定量的に正確に見たいのですが何か良い方法はありますか？

(無題) 削除/引用 No.4147-2 - 2007/05/08 (火) 19:07:29 - A 一番確実なmRNAの定量方法はノーザンブロットで定量でしょう。 目的のｍRNAが少量の場合は出来ませんが目的の遺伝子の発現量は どうですか? もしPCRで定量するならcDNAを準備してからリアルタイムPCRする ほうをお勧めします。理由は各サンプルで逆転写の効率が何時も 同じになるとは限らないからです。先にcDNAを準備すれば出来 上がったcDNAライブラリー中のハウスキーピング遺伝子の量を リアルタイムPCRによって測定しそれを元に各サンプルでの 逆転写の効率を正規化出来るはずです。それを元に各サンプル間 で定量的な比較が出来るはずです（理論的にですが）。 ただ別のトッピックでも書いたのですがPCRによる定量はテンプレート cDNAほんのわずかな違いでも（例えばピペッティングの違いで生じる 0.01uLのような）それを検出して大きな違いがあるかのような結果が 出てしまいます。ですからN数をかなり稼がないと（個人的な見解ですが 少なくとも１グループ当り100はほしい）信頼のおけるデータには ならないと思います。N数が増えて統計処理すればそのような誤差が だんだん平たくなってくるでしょうから。まとめると １．できればノーザンブロット ２．cDNAライブラリーを準備して正規化した後にリアルタイムPCR

mRNAの定量について 削除/引用 No.4147-1 - 2007/05/02 (水) 15:21:38 - Yamada 遺伝子発現を調べる実験を計画しています。 mRNAの定量方法にリアルタイムPCRやCompetetive RT-PCRがありますが、 これらの実験においてRNAをcDNAに変換してからPolymeraseでPCRを行う方法と、 RNAから直接逆転写とPCRを行う方法がありますが、どちらの方法がより、鋳型のmRNA量を正確に定量できるのでしょうか？ 安定性といった面ではcDNAの方が良いとは思うのですが、 Superscriptなどの逆転写酵素の効率に差がでることを考えるとRNAから直接測定するほうが良いような気もします。 どなたかmRNAの定量に詳しいかた教えてください。

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