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(無題) 削除/引用 No.4064-17 - 2007/05/21 (月) 18:54:35 - poo 栄養面は卵の質に影響するのかを最近ぽつぽつ考えていたので、聞いてみました ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.4064-16 - 2007/05/20 (日) 23:17:32 - けい > すみません、もうひとつ聞きたいことがあるのですが、飼育していたゼノパスのえさって何でしたか？ 飼育にはあまり詳しくないので、ちょっとわかりません。御力になれなくてすみませんです。ただ、エサはあまり関係ないのではないでしょか？

(無題) 削除/引用 No.4064-15 - 2007/05/20 (日) 19:13:36 - poo すみません、もうひとつ聞きたいことがあるのですが、飼育していたゼノパスのえさって何でしたか？ 基本的なことを聞いてしまってすみませんが、よろしくお願いします！

(無題) 削除/引用 No.4064-14 - 2007/05/20 (日) 19:08:41 - poo そうですよねぇ・・・ひたすらインジェクションしてみます！

(無題) 削除/引用 No.4064-13 - 2007/05/20 (日) 12:55:10 - けい > 良質並んだと死亡率は下がるものですか？ 以前も書きましたが、１０００個の未受精卵にインジェクションした場合、良いときで２００匹ほど（悪いときで０匹；全滅）生き残ります。 私は、ひとサンプルごとに１０００個はうちました。また、最低3回は再現性を確認しました。 ただし、途中うってもうっても死んでしまうときもありました。実験手法と試薬は同一なので、違うのは卵の品質くらいかな？と思います。

(無題) 削除/引用 No.4064-12 - 2007/05/19 (土) 16:34:02 - poo REMI法で制限酵素抜きで行っています。 良質並んだと死亡率は下がるものですか？

(無題) 削除/引用 No.4064-11 - 2007/05/19 (土) 13:39:32 - けい > 未受精卵抽出液を加えてインジェクションをはじめてみました。 が、正常に発生する個体が激減しており途方にくれています。これは仕方がないことなのでしょうか？それとも何か原因があるのでしょうか？ ひょっとして、REMI法を用いていますか？ 実験医学別冊　クローズアップ実験法　総集編、「トランスジェニックカエルの作成方法」の項には、精子核懸濁液に制限酵素を加えると正常に発生する胚の割合が優位に減少するとあります。 > また、卵の質がトランスジェニックをうまくいかせるためには重要と聞きました。この質をよくするためにはどーするといいのでしょうか？ とりあえず、私は良い卵にたどり着くまで、何度も実験を繰り返しました。 メスに卵を産ませるためにホルモン注射をしますが、HCGの注射の数日前にPMGCをうつと卵が良くなるという話を聞いたことがありますが、実際のところはよくわかりません。 どなたか、詳しい方、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4064-10 - 2007/05/18 (金) 13:39:46 - poo 未受精卵抽出液を加えてインジェクションをはじめてみました。 が、正常に発生する個体が激減しており途方にくれています。 これは仕方がないことなのでしょうか？それとも何か原因があるのでしょうか？ また、卵の質がトランスジェニックをうまくいかせるためには重要と聞きました。この質をよくするためにはどーするといいのでしょうか？ ご存知の方がいましたら教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.4064-9 - 2007/04/23 (月) 19:46:10 - poo ありがとうございます。 膨潤を加えて再チャレンジします！

(無題) 削除/引用 No.4064-8 - 2007/04/20 (金) 19:02:20 - けい >やはり未受精卵抽出タンパク質がないとうまくDNAがはいらないのかなぁ・・・ 卵抽出液により精子核が膨潤しインテグレイトされる（はず）です。卵抽出液がなくても、精子核を未受精卵にインジェクションすれば受精はしましたよ。ただし、トランスジェニックはできませんでした。

(無題) 削除/引用 No.4064-7 - 2007/04/20 (金) 15:52:36 - poo ありがとうございます やはり未受精卵抽出タンパク質がないとうまくDNAがはいらないのかなぁ・・・

(無題) 削除/引用 No.4064-6 - 2007/04/16 (月) 22:39:04 - けい >ちなみにけいさんがトランスジェニックを作製した際は未受精卵抽出タンパク質を使って膨潤させてますか？ 私は未受精卵から卵抽出液をとり、精子核を膨潤させ、直鎖状にしたDNAとともに未受精卵にインジェクションをしました。

(無題) 削除/引用 No.4064-5 - 2007/04/16 (月) 21:03:30 - poo なるほど、非常に参考になります。 ちなみにけいさんがトランスジェニックを作製した際は未受精卵抽出タンパク質を使って膨潤させてますか？膨潤させるべきかどうかで迷っています、教えていただけるとうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.4064-4 - 2007/04/15 (日) 15:36:42 - けい >ちなみに、けいさんが作製されたときには、一腹からどれぐらいの数のオタマジャクシができ>て、どれくらいが遺伝子導入されていましたか？ 一腹の意味がよくわかりませんが、例えば１０００個の未受精卵にインジェクションした場合、良いときで２００匹ほど（悪いときで０匹；全滅）正常に所定のステージまで生存しました。そのうちトランスジェニックされていたのはだいたい3割から６割ほどです。多分、インジェクションする卵の質に生存数が由来していると思うのですが、もう少しコンスタントに生き残ってほしいところです。

(無題) 削除/引用 No.4064-3 - 2007/04/14 (土) 20:24:20 - poo なるほど、in situによる確認は考えていませんでした。試してみようと思います。 ちなみに、けいさんが作製されたときには、一腹からどれぐらいの数のオタマジャクシができて、どれくらいが遺伝子導入されていましたか？参考にしたいので教えていただけたらうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.4064-2 - 2007/04/14 (土) 18:29:14 - けい >何が悪いのか2〜3個体分の卵にインジェクションしても正常なおたまじゃくしが得られるだけで>GFP発光している個体が1個体も得られませんでした。 詳しい方法が書かれていないのでよくわかりませんが、In situはしましたか？使用するプロモーターが弱い場合、GFPの蛍光がみられないことが多々ありますよ。私も、Cardiac actin プロモーターではGFPの蛍光が観察できましたが、目的のプロモーターでは全く光りませんでした。しかし、GFP mRNAのIn situをするとちゃんと発現していましたよ。 >また、日本人で制限酵素は用いないが、未受精卵抽出タンパク質をもちいてからインジェクショ >ンしている例があるようです。やはりこちらのほうが成功率は高いのでしょうか？あわせて教え >ていただけるとうれしいです。 高い成功率を望むなら、私は試したことがないのですが、最近いろいろ新しい手法が出てますよ。例えば、I-SceIを用いたものなどです。

transgenic xenopusの作製のコツ 削除/引用 No.4064-1 - 2007/04/14 (土) 18:01:17 - poo 現在、Sparrow et al (2000)の方法に従ってトランスジェニック個体の作製を試みています。導入する遺伝子の上流にはGFPが組み込まれているため発現すると一目でわかるようにしてあるのですが、何が悪いのか2〜3個体分の卵にインジェクションしても正常なおたまじゃくしが得られるだけでGFP発光している個体が1個体も得られませんでした。この原因がなんなのかわからずに困ってます。経験者の方がいましたら、アドバイスをお願いします。また、日本人で制限酵素は用いないが、未受精卵抽出タンパク質をもちいてからインジェクションしている例があるようです。やはりこちらのほうが成功率は高いのでしょうか？あわせて教えていただけるとうれしいです。

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