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コーティングスライドの扱いについて 削除/引用 No.4045-17 - 2008/01/18 (金) 18:02:35 - stama パラフィン切片をマツナミMASコートのスライドグラスで免疫染色しています。４７℃湯伸ばし、同温１晩伸展、染色前に６８℃で１時間パラフィン融解後常温にして脱パラします。（パラフィン融点６７℃の場合） 抗原賦活には家庭用圧力鍋で劇的な効果がありました。オートクレーブで剥離していたものは高ｐＨのものも全てクリアーできました。染色もうまくいって喜んでいたところ、切片を染色前に床に落としたときのゴミがコーティングの中に入りこんで最後まで残ってしまい、がっくりしています。ＴＢＳにtwwn20を入れて洗ってみましたが、少ししか効果がないようです。 経験された方がいらっしゃったらご教示ください。

遅くなりましたが　−補足− 削除/引用 No.4045-16 - 2007/07/13 (金) 19:53:49 - 免疫染色 結局、 ４％APESスライドにのせた後、３７度で１−２日乾燥→６０度２−３時間でパラフィンを完全に溶かす→XyleneでDewax 電子レンジ処理は450Wで沸騰させてから300Wで穏やかにBoil という方法でうまくいきました。 薄切からDewaxまでは一気にやったほうが、乾燥→室温で保存→60度よりいいようです。 みなさんアドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4045-15 - 2007/04/23 (月) 19:13:57 - 免疫染色 APESスライドでもう一度やってみたところ、２つは最後のマウントのところまでこぎつけることができました。 あとの２つもまた試してみます。 アドバイスを下さった方々、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4045-14 - 2007/04/18 (水) 20:01:37 - 免疫染色 報告までに。 VBスライドで60度１時間もう一度パラフィン溶融をして、すぐにDewaxという方法を試してみました。 最終的にはマイクロウェーブ後剥離してしまいました。(４個中２個脱落、２個半分剥離） が、今までDewaxもしくはRehydrationで完全に脱落していた切片が、マイクロウェーブ前まで部分的剥離もなくスライドガラスにくっついていたので、この方法は結構有効なようです。 複数回コートのスライドガラスで同じ方法でやればうまくいくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4045-13 - 2007/04/17 (火) 18:45:46 - 免疫染色 千さん >私は、組織を傷つけないよう、パラフィンのみの部分に小さな穴を開け、スライドガラスを軽く振るか、キムワイプなどで水を吸い取ります。 そして、40〜50℃に設定したパラフィン伸展器上で20分程度乾燥させてから、パラフィン溶融器に移してます。 パラフィンとスライドガラスの間の水については、研究室のテクニシャンのかたに注意をされていたので、これは私もやっています。10-20μmだとこれでかなりはがれにくくなるようです。30μｍでは効果は微妙ですが。 >室温保存の切片については、数日以上室温に置いたものを普通に脱パラすると、かなりはがれやすいように思います。ですが、室温・数日以上保存の切片についても、脱パラ前にもう一度、パラフィン溶融器に１時間程度入れ、パラフィンが再び固まらないうちに脱パラすることで多少はがれにくくなります。 なるほど、パラフィンが固まらないうちに脱パラするといいんですね。一回冷ましてからかと思ってました。今日、余っているベクタボンスライド切片でちょっと試してみます。 Eireさん >染色後の切片は平たい絵筆ですくってスライドグラスに載せますが、破れたりはしていません。腔所が大きな割合を占める組織（胎生期の終脳など）を扱うときは注意が必要ですが、実質で占められているような組織については大丈夫だと思います。 結構丈夫なんですね。万策つきた場合はFree-floatingを試してみます。染めないことには結果も得られないので．．．脱落するのが絶対にはずせないControlなのが痛い。 千さん、Eireさんありがとうございました。

切片の乾燥について・補足 削除/引用 No.4045-12 - 2007/04/17 (火) 17:48:25 - 千 切片の乾燥の仕方について、ちょっと説明不足でしたので補足させていただきます。 コーティングスライドの場合、一度切片をのせてしまうとシワがあった場合伸びてくれないので、40〜50℃のお湯に浮かべてシワを伸ばしてから拾いますよね。その後、パラフィン伸展器にスライドガラスをのせて伸展・乾燥させますが、このとき、切片とガラスの間に水が残ることがままあります。 私は、組織を傷つけないよう、パラフィンのみの部分に小さな穴を開け、スライドガラスを軽く振るか、キムワイプなどで水を吸い取ります。 そして、40〜50℃に設定したパラフィン伸展器上で20分程度乾燥させてから、パラフィン溶融器に移してます。 室温保存の切片については、数日以上室温に置いたものを普通に脱パラすると、かなりはがれやすいように思います。 ですが、室温・数日以上保存の切片についても、脱パラ前にもう一度、パラフィン溶融器に１時間程度入れ、パラフィンが再び固まらないうちに脱パラすることで多少はがれにくくなります。 私も免疫染色にはかなり苦労しました。うまくいくといいですね。

(無題) 削除/引用 No.4045-11 - 2007/04/17 (火) 05:52:42 - Eire > free-floating はやったことがないのですが、大き目の切片（3cmｘ4-5cm)でもやぶれたりせずできるのでしょうか。 　それだけ大きな切片で、なおかつパラフィン切片にしたものについては扱ったことはないので何とも言えないですが、ビブラトーム切片（厚さ５０ミクロン；低融点アガロースに包埋）については意外に強いです。染色後の切片は平たい絵筆ですくってスライドグラスに載せますが、破れたりはしていません。腔所が大きな割合を占める組織（胎生期の終脳など）を扱うときは注意が必要ですが、実質で占められているような組織については大丈夫だと思います。 ただ、アガロース包埋した組織の切片や凍結切片の場合、プラスチック製マルチウェルディッシュで最初からできますが、パラフィン切片の場合キシレンがプラスチックを溶かすので、free-floating を試すにしても脱パラはガラス容器で行う必要があり面倒くさいですね。また、それだけ大きいと使用する抗体の量もかなりのものになるでしょうし。 　そのような大きな切片であることを想定してませんでした。すみません。

(無題) 削除/引用 No.4045-10 - 2007/04/16 (月) 21:34:12 - 免疫染色 > スライドグラスに貼り付ける必要がどうしてもあるのであれば参考にはならないのですが、必ずしももそうでないのであれば free-floating の状態で免疫染色という手もあります。 細胞数を顕微鏡下でカウントするので、最終的にはスライドガラスに貼り付ける必要があります。 free-floating はやったことがないのですが、大き目の切片（3cmｘ4-5cm)でもやぶれたりせずできるのでしょうか。

それだけ厚い脳組織切片であれば・・・・ 削除/引用 No.4045-9 - 2007/04/14 (土) 16:45:17 - Eire スライドグラスに貼り付ける必要がどうしてもあるのであれば参考にはならないのですが、必ずしももそうでないのであれば free-floating の状態で免疫染色という手もあります。パラフィン厚切り切片を使ったものは実際は論文で見たことはないですが、脳に関しては凍結切片やビブラトーム切片の free-floating での免疫染色というのは割と普通に行われています。

千さんレスありがとうございます 削除/引用 No.4045-8 - 2007/04/13 (金) 18:40:09 - 免疫染色 >切片の乾燥を37℃で行われているとのことですが、私の場合、パラフィン溶融器(62℃程度)中に１〜数時間置いて乾燥させています。 37度乾燥後、インキュベータ(60度)30分いれてパラフィンをとかしてるのですが、もっと長く入れたほうがいいのかもしれませんね。いきなり60度に入れて大丈夫なのかちょっと心配なところもあるのですが。 >私の経験上は、パラフィン切片を室温で長く保存したものほど剥離しやすいように思います。 それは気づきませんでした。湿度と関係してるのでしょうかね．．． APESコートｘ２を試すときには、乾燥、パラフィン溶融から間を空けずに免疫染色をしてみます。 アドバイスありがとうございました。

乾燥時の温度・続き 削除/引用 No.4045-6 - 2007/04/13 (金) 17:40:04 - 千 失礼しました、文章を入力する前に送信してしまいました。 あらためまして・・・、 切片の乾燥を37℃で行われているとのことですが、私の場合、パラフィン溶融器(62℃程度)中に１〜数時間置いて乾燥させています。 そして、キシレンに入れる前にドライヤーで切片のパラフィンを、もう一度しっかり溶かしてから、脱パラしています。 私の経験上は、パラフィン切片を室温で長く保存したものほど剥離しやすいように思います。 賦活化は、ビーカーにバッファーを入れ、スライドキャリアに入れた切片を沈め、そのビーカーを直接直火にかけてます。 ちょくちょく様子を見て、火の調節を最大限弱くして20分程度Boilします。 とはいえ、ここまで厚い切片は扱ったことがないので、どこまで通用するかは分かりませんが、ご参考になれば幸いです。

乾燥時の温度 削除/引用 No.4045-5 - 2007/04/13 (金) 17:28:10 - 千

(無題) 削除/引用 No.4045-4 - 2007/04/12 (木) 20:15:20 - 免疫染色 レスありがとうございます。 乾燥は３７度２−３日間行っています。 その後室温で１日ほど置いておくので、乾燥はしっかりできてると思うのですが。 スライドガラスは自作ですので、コーティングを２−３回するのはいいかもしれませんね。早速やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4045-2 - 2007/04/12 (木) 10:28:54 - 組織 確認ですが，薄切後の乾燥はどうやってますか？ もうやってるとは思いますが，通常の切片よりもかなりしっかり乾燥させたほうが良いですね． スライドガラスは既製品でなく自分でコートしたものですか？ 自作なら，コーティング操作を2-3回繰り返してやると，接着力が少し強くなります． あとはマイクロウェーブですが，沸騰したら電力をできるだけ小さく（解凍モードなど）してやれば，剥離を抑えられるかもしれません． 沸騰してしまえば，激しく沸騰させようが緩やかに沸騰させようが，熱処理効果はそれほど変わらないでしょうから． あるいは，オートクレーブに変えても良いかもしれません． これだけ厚いと難しいと思いますが，頑張ってください．

パラフィン切片がスライドガラスから薄利してしまいます 削除/引用 No.4045-1 - 2007/04/11 (水) 21:33:58 - 免疫染色 ３０μmの脳組織切片(パラフィン）を免疫染色しようとしています。 １８サンプル中、４個だけ、ﾇうしても最初のDewax（キシレン）かRehydrationで、組織全体、もしくは一部が薄利してしまい、電子レンジ処理でとどめをさされてしまう状況です。 スライドガラスのコートは、４％APES、ベクタボン両方試してみましたが、どちらでも、結果は変わらず。 実験の都合上、切片を薄くすることはできないので困っています。 どなたか切片をスライドガラスにとどめるよい方法をご存知の方がおられましたら、お教えください。

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