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Kazu 削除/引用 No.3906-17 - 2007/05/23 (水) 20:31:14 - Kazu 　膵島分離でよい成績をあげるためにはductal injection、すなわち総胆管穿刺が必須となります。hikiさんの仰るように総胆管穿刺ができるようになれば膨化部分ですぐに膵臓の境界が分かるので、摘出も容易です。 　膨化には1-2mg/mlのコラゲナーゼVIIIを用いています。 　膨化液が十二指腸へながれないようにするために小さめの曲がりのミクリッツかモスキート鉗子で十二指腸をかみ、Vater乳頭を遮断します。 　総胆管を剥離し、ラットであれば25Gか26Gの翼状針で穿刺して膨化します。注入する量は5-7ml位です。 　膵尾部まで完全に膨化してください。 　日本には膵島移植認定施設が７つあります。そこで実験している人に聴いてみてはいかがでしょうか？

総胆管への還流法 削除/引用 No.3906-16 - 2007/05/12 (土) 11:56:24 - hiki 膵島単離には苦労させられましたが、以下の方法により成功率１００％になりました。 マウス、ラットともに経験しましたがラットの方が手技的には容易です。 総胆管への刺入、コラゲナーゼ液の注入がポイントだと思います。 当方ではポリエチレンチューブを総胆管にカニュレートしチューブを 介してコラゲナーゼ液を注入しています。これにより、膵全体に液が行き渡り膵全体が膨化します。つまり膨化した部分を摘出すればOKです。 この方法は、コラゲナーゼ処理が確実になり安定した収量を確保出来ます。 いずれにしろ一度は単離経験のあるラボで見た方が早いと思います。 当方でしたらいつでも構いません。 ご検討ください。

(無題) 削除/引用 No.3906-15 - 2007/03/14 (水) 18:55:16 - りさ 還流はやっぱりやった方がいいみたいですね。私もやってはいるのですが総胆管が細くて針を刺すのが難しいし本当に還流されているのかちょっと自信ないですが頑張って続けていこうと思います。 コラゲナーゼは色々な濃度や時間で試してはいるのですがハサミで細かくしたときの粒がまだ消化されずに残っているような気してうまく消化されていないのかなとも思っています。コラゲナーゼ液の量を増やしたりコラゲナーゼの溶かす量を増やしたり反応時間を長くしたりして検討してみますね。

(無題) 削除/引用 No.3906-14 - 2007/03/14 (水) 17:34:36 - さ >ちなみにささんは膵臓を採るとき総胆管からコラゲナーゼなどで還流はしていますか？ もちろんやっています。 何度か還流せずに試したこともありますが、isletのqualityとquantityがものすごく悪くて実験には使えませんでした。 >マウスではどのくらいのコラゲナーゼの濃度を用いて何分くらい消化していますか？？ おそらくコラゲナーゼのメーカー、ロットによって力価が全く違うので、参考にならないと思います。今使っているコラゲナーゼで最適の濃度を検討されるほうがいいと思いますよ。時間はこれも力価によって大きく異なるので参考にはならないと思いますが僕の場合20分前後です。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3906-13 - 2007/03/14 (水) 16:25:55 - りさ 私もコラゲナーゼの消化については色々とやってはいるのですが本当に合っているのかは分からないことが多いのです。 ちなみにささんは膵臓を採るとき総胆管からコラゲナーゼなどで還流はしていますか？そしてマウスではどのくらいのコラゲナーゼの濃度を用いて何分くらい消化していますか？？

(無題) 削除/引用 No.3906-12 - 2007/03/14 (水) 01:10:16 - さ ＞ささんはマウスでどのように膵島単離を行っているのですか？？ 僕の場合、Ficollは用いず、sucrose bufferを用いてisletの比重だけで主に外分泌組織と内分泌組織(islet)を分けています。 りささんのようにFicollを用いた単離方法を知らないので、残念ですが今のトラブルの打開策を知りません。 しかしながら、いくつか問題点はあるように思います。 今の段階で膵島がきちんと確認できているのでしょうか？ これが一番の問題です。 isletの単離に重要なことは、きちんと外分泌組織と内分泌組織を分けてやるためにしっかり消化してやらなくてはいけません。 それが出来ていないような気がします。 膵島単離には、�@膵臓の内部からの消化�Aコラゲナーゼの濃度、消化時間 が重要です。 このあたりは理解しているでしょうか？ これらのことを言葉では説明できるのですが、単離操作には多くの過程を要しますし言葉では伝わらないことが多いので、現段階ではやはり身近で単離経験のある人からきちんとした単離方法をしっかり見せてもらいそれに忠実に再現する方が良いと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.3906-10 - 2007/03/13 (火) 15:58:49 - りさ 十二指腸あたりから膵臓と思われるところを取ってハサミで細かくしコラゲナーゼで処理した後Ficoll-Conrayの比重遠心法で分離しようと試みています。この方法で1.048と1.072の境界面に膵島細胞が集まってくるみたいなのですが、うまく境界面にあがってきません。 最初は膵臓がうまく取れていないのかなって思ったのですが、このFicoll-Conray液がいけないのかとも思いFicollのみで比重遠心をやってみたのですがそうするとほぼ全ての沈殿が境界面にあがってきてしまいます。 ささんはマウスでどのように膵島単離を行っているのですか？？

isolation 削除/引用 No.3906-9 - 2007/03/12 (月) 22:07:24 - さ ラットでは経験ないですがマウスの膵島単離を行っています。 何か分からないことがあれば少しはお話しできると思うので問題点等示してください。

みなさん、ありがとうございます！ 削除/引用 No.3906-8 - 2007/03/12 (月) 12:07:05 - りさ 教えていただいた色々な方法で試してみたいと思います。 もしダメなときは膵島を扱っている研究者の方を探して直接聞いてみることにしますね。 多くの返答ありがとうございました。がんばってみます。

膵島をとるとき 削除/引用 No.3906-7 - 2007/03/08 (木) 00:46:02 - たま 膵島を単離するときにはコラゲナーゼ処理するのが一般的ですが、使ってますか？膵島の単離は一度は上手なひとのを見ないと難しいと思います。

欲しいのは膵島ですよね？ 削除/引用 No.3906-6 - 2007/03/07 (水) 19:47:14 - islet 膵臓を見分けて摘出するのは簡単ですが、 トピ主さんが実験に欲しいのは膵島ですよね？

簡単に区分けできますよ！ 削除/引用 No.3906-5 - 2007/03/07 (水) 13:24:47 - タル！ 胃−小腸上部1//3ぐらいに付着している脂肪組織らしきものをすべて切り出します。腸管に沿ってはさみをいれれば引っ張ることでキレイに取れます。これをPBSにいれてください。沈むのがすい臓、浮くのが脂肪です。浮くものを切り取っていけばすい臓のみを摘出できますよ！

十二指腸曲部にあります 削除/引用 No.3906-4 - 2007/03/07 (水) 12:02:28 - 獣医学部生 膵臓の色調は淡黄白色ですので脂肪と似ているかもしれませんが，十二指腸に密接している臓器ですのである程度の見当は付くと思います。正確には十二指腸曲という十二指腸が曲がっているところ辺りにあると思います。十二指腸曲が分かり難ければ，胃噴門部と直腸で消化管を取り出し，両端を引き消化管をまっすぐにすると十二指腸曲の部分が分かると思います。これは病理解剖などで使う方法ですので研究に使うべきなのか分かりません。正規の方法などありましたらご教授いただけると幸いです。 あとはマウスやラットの解剖学アトラスなどをご覧になるのも良いのではないでしょうか。

経験者に直接教えてもらいましょう 削除/引用 No.3906-2 - 2007/03/07 (水) 11:09:00 - islet 膵島を単離するには多くのコツが必要です。 膵臓の見分けもつかないのに、いきなり膵島を単離するのは 無理だと思いますよ。 膵島を取っている経験者がいるラボにアポを取って、 直接教わりに行くのが一番の近道でしょう。

膵島単離 削除/引用 No.3906-1 - 2007/03/06 (火) 19:46:39 - りさ いまラットの膵島細胞の単離でうまくいかず、大変な思いをしています。十二指腸についている脂肪組織っぽいところを取っているのですが、どうも場所が違うような気がしています。どなたか、ラットの膵臓を使って実験されている方、ぜひアドバイス下さい。よろしくお願いします。

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