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(無題) 削除/引用 No.3546-11 - 2007/05/11 (金) 12:22:41 - ひろ CalbiochemのProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kitで細胞膜分画をきれいにとれますよ。

可溶化剤 削除/引用 No.3546-10 - 2007/05/09 (水) 23:48:54 - plasma membrane >クロマチンさん (Urea入りのbufferでカラムに通している論文があったので、良いんだと思ってしまって・・・、後で確認したら、抗体じゃなくて、Niとアビジンカラムでした。) 質問のところに重ねて質問して申し訳ありません。 現在タンパク質の可溶化剤を検討中です。 可溶化後にアビジンカラムを通すつもりなのですが、もしよろしければ上記の論文のタイトルを教えていただけないでしょうか。 突然に申し訳ありません。 お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3546-9 - 2007/01/06 (土) 23:31:17 - クロマチン >レムリさん アドバイスありがとうございました。 色々試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3546-8 - 2007/01/03 (水) 15:40:09 - レムリ ureaは強い変性効果があるし、疎水結合も弱める効果があるそうなので膜蛋白質の可溶化には有効だと思います。ただSDSみたいに蛋白質に強く結合していないと思うので、希釈すると蛋白質が中途半端に変な風に再生して不溶化してしまうことがあります。いずれにしても、どのような試薬をもちいるにせよ、再不溶化を避けるため、希釈後はすみやかに免疫沈降に進み、抗体反応も必要最小限の時間で済ませるのが大切かと思います。目的の蛋白質か希釈時の不溶化などによるバックグラウンドかを判別するためnormal　IgGによるコントロール実験もしてください。

ボイルすると外れるみたいです。 削除/引用 No.3546-7 - 2006/12/31 (日) 00:17:43 - クロマチン 僕が読んだ論文によると、ボイル(96度、20分)するとクロスリンクが外れるみたいですよ。(ホルムアルデヒドでクロスリンクしていました。) 他にも外す方法はあるみたいですが、僕が知っているのはそれだけです。 実際、その方法でIPで釣り上げた蛋白質をMSで同定しているようです。

(無題) 削除/引用 No.3546-6 - 2006/12/30 (土) 18:40:37 - シュン クロスリンカーを使うと、リジンやN末のアミノ基がブロックされてしまうので、MSやペプチドシークエンスには使えない様に思いますが、クロスリンカ−の量などを工夫することでMSにも適用できるのでしょうか？

ありがとうございます。 削除/引用 No.3546-5 - 2006/12/29 (金) 23:40:33 - クロマチン なるほど。 界面活性剤を色々と試して、最適条件を探すしかないですね。 >こうした面倒を避ける一つの方法として、DSPのような膜透過性蛋白質架橋剤を用いてはどうですか。 つい最近、クロスリンクさせてIPしてMSで同定している論文を見かけたので、それについても試しているところです。DSPは知りませんでした。今は、ホルムアルデヒドで実験していますが、検討してみます。 >これで生細胞を処理して蛋白質同士を共有結合させてた後で、SDS（１ないし２％くらい）のような強い界面活性剤で全膜蛋白質を抽出し、 一応Urea、Thiourea、Chapsで可溶化させてみました。(強い方が良いかなと思いまして・・・。) それでも大丈夫ですかね? >その後非イオン性の界面活性剤入りの適当なbufferで１０−２０倍くらいまで希釈して（もし不溶物が生じたら遠心してしっかり除く）から免疫沈降してみて下さい。 そうですね。希釈しないと、抗体が壊れてしまいますよね・・・。 凡ミスしてしまいました。(可溶化剤のままIPしてしまい、失敗しました。) (Urea入りのbufferでカラムに通している論文があったので、良いんだと思ってしまって・・・、後で確認したら、抗体じゃなくて、Niとアビジンカラムでした。) 次は、希釈して再度トライしたいと思います。 >抗体がポリクロ、モノクロ両方あるなら、（エピトープ構造が架橋によって変化しているとうまく行かないので、）この場合はポリクロのほうがいいかもしれません。 ポリクロしかないので、それでやってみます。 レムリさん、大変貴重なアドバイス、ありがとうございました。 本当に助かりました。

SDSで溶かしたら。 削除/引用 No.3546-4 - 2006/12/29 (金) 02:24:23 - レムリ 界面活性剤はもちろん種類や濃度にもよると思いますが、その多くは分子間相互作用を弱める（あるいは壊す）と考えられます。可溶化できて、かつ相互作用への影響は最小限になるようなちょうどいい濃度を決める事が必要でしょう。こうした面倒を避ける一つの方法として、DSPのような膜透過性蛋白質架橋剤を用いてはどうですか。これで生細胞を処理して蛋白質同士を共有結合させてた後で、SDS（１ないし２％くらい）のような強い界面活性剤で全膜蛋白質を抽出し、その後非イオン性の界面活性剤入りの適当なbufferで１０−２０倍くらいまで希釈して（もし不溶物が生じたら遠心してしっかり除く）から免疫沈降してみて下さい。抗体がポリクロ、モノクロ両方あるなら、（エピトープ構造が架橋によって変化しているとうまく行かないので、）この場合はポリクロのほうがいいかもしれません。

ありがとうございました。 削除/引用 No.3546-3 - 2006/12/22 (金) 13:29:13 - クロマチン レス遅れて申し訳ありません。 アドバイスありがとうございました。 SB3-10という界面活性剤の存在は知りませんでした。 あと質問なんですが、Chapsは蛋白質間相互作用を破壊するという記載を見かけたのですが、それでも使っているのは蛋白質の可溶化を優先しているからということで良いのでしょうか?(僕はそのつもりで使っていますが、どうなのかと思いまして･･･。) ChapsやSB3-10といった可溶化力の強いdetergentを使っても相互作用分子を釣ってこれるものなのでしょうか? もしこれらを使って相互作用分子を同定したという論文等があるようでしたら、教えて頂けないでしょうか? もしくは差し支えなければ、どういった組成で現在実験しているか教えて頂ければ幸です。 注文が多くてすみません。

(無題) 削除/引用 No.3546-2 - 2006/12/20 (水) 16:18:41 - 名無し 私もMSを利用しているものの1人ですが、膜タンパク質などの溶けにくいタンパク質を相手にするときは、Tritonだと歯が立たないのでSB3-10とCHAPSを組み合わせて行っています。組成はともに終濃度が2%になるようにしました。これですこしは改善されるのではないでしょうか？

膜蛋白質の免疫沈降 削除/引用 No.3546-1 - 2006/12/19 (火) 18:12:25 - クロマチン ある細菌の膜蛋白質と相互作用する菌体因子を釣り上げようと考えています。 タグ付蛋白質を菌体内に発現させ、タグに対する抗体で相互作用分子を落としてきて、SDS-PAGE後、MSで同定しようとしていますが、今のところうまくいっていません。 菌を溶解させる段階が重要だと思うのですが、膜蛋白質なのでうまく可溶化できないです。 何か良いdetergentはありますか? 2%TritonX-100単独ではその蛋白質を可溶化できないので、現在は、2%TritonX-100、0.5%DOC、2%Chapsといった複数のdetergentを組み合わせて溶かそうと試みています。 何かアドバイスあれば、お願いします。 また参考に出来る文献、実験書等ありましたら、教えていただければ幸いです。

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