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始めました 削除/引用 No.3314-12 - 2006/11/07 (火) 14:36:02 - DSC raceさん、ご親切な情報のご提供に感謝致します。。 おかげさまで、オリゴの具体的な仕掛けがわかりました。 下のKさんのように、とりあえず無修飾のDNAオリゴで実験を始めています。 後日、結果をお知らせしたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3314-10 - 2006/11/05 (日) 14:50:09 - race こんなのもありました。発明者？ http://www.evrogen.ru/t2.shtml

(無題) 削除/引用 No.3314-9 - 2006/11/05 (日) 14:47:14 - race templete-switchingの原理自体を特許で押さえてあるようですので、DNA-RNAキメラ以外に公開していない修飾があるというのは、ホントに？という気がします。 http://www.patentstorm.us/patents/5962272-fulltext.html

(無題) 削除/引用 No.3314-8 - 2006/11/05 (日) 14:29:58 - race これかな？うちからは読めないんで、定かではありませんが。 5' RACE by Tailing a General Template-Switching Oligonucleotide Xianzong Shi and Susan G.W. Kaminskyj BioTechniques Vol. 29, No. 6: pp 1192-1195 (Dec 2000)

ありがとうございます 削除/引用 No.3314-7 - 2006/11/05 (日) 09:01:25 - DSC そばさん、情報ありがとうございます。 宝酒造-Clontechのサイトは気づいていなかったので、参考になりました。 そういえば、SMARTのオリゴはDNA-RNAキメラだと聞いた気がします。 （おっと、こういう話題こそあまりオープンにしてはいけないのかも） 以前、SMARTキットのうちRTaseだけ早く使い切ってしまったときに、他社のRTaseでもうまくいくかClontechのテクニカルサービスに訊いてみたことがあるのですが、そのときは「わからない」との返答でした。今は手元にPOWERSCRIPTがあるのですが、そうでなくともなんとかなりそうですね。 KさんはDNAオリゴでうまくいっておられるみたいですし、効率悪いのは覚悟の上で、とにかくやってみます。

(無題) 削除/引用 No.3314-6 - 2006/11/04 (土) 18:49:49 - そば dNTP濃度に関しては取り扱い説明書に「dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM）」って書いてあるので、同一濃度で問題無いはずです。 5xのバッファーも取り扱い説明書通りで問題無いと思います。 ただ、SMARTオリゴに関してはSMART法のQ&A、一番最後の質問を見てください。 http://clontech.takara-bio.co.jp/qa/smart.shtml Q&Aにあるように修飾が非公開なので、普通にDNAでオリゴを合成した場合、従来よりも効率が落ちることは覚悟した方がいいと思います（できないと書いてありますけどね・・・） 効率を上げる方法は調べればある程度の情報は得られますけど、あまりオープンにしていい話題とも思えないので、ご自分で頑張って調べて頂くしかないかと。 ちなみに他のRTaseでもできるものもあるようです（Q&Aにも書いてありますよね） 少なくともSuperScriptII RNaseH-で行ったという論文を見たことがありますし、そもそもSMART法の特許申請の際の実験もその酵素で行われているみたいですよ。

言葉不足 削除/引用 No.3314-5 - 2006/11/02 (木) 21:51:46 - K 失礼しました。 スメアなバンドの中にサテライトなGAPDHのバンドがみえればOKですといういみです。 やはり、何サイクルか振ってみて最適なサイクルを決定されることをおすすめします。 ただし、経験上16サイクルから24サイクルで決まりそうです。

ご回答ありがとうございます 削除/引用 No.3314-4 - 2006/11/02 (木) 20:25:00 - DSC Kさん、ご丁寧な解説ありがとうございます。 同志の方がおられて嬉しいです。 確かに、頻繁に購入できる価格ではありませんから。 ・dNTPはTaqなどの付属品で十分 ・5×バッファーは自作・フィルター滅菌 ・オリゴのグレードと保存に注意 ということですね。早速参考にさせて頂き、実践します。 最後に書かれていた「GAPDHなんかがスメアにみえていればOK」というのは、コントロールとしてPCRをやってみた場合のことでしょうか？ お時間ありましたら、ご回答をお願い致します。

問題があると怖いですけど 削除/引用 No.3314-2 - 2006/11/02 (木) 19:30:39 - K 私は自作しています。 前の質問などでPCR select-cDNA subtraction kitのバッファーを作ろうと試みている人間です。 正直、私のラボは金銭的にクロンテックのキットをたびたび買えるような資本はありません。ので基本的に自作です。 ちなみにpowerscript以外全て自作しています。dNTPsは通常濃度のもの。promegaのTaqなんかを大量に買うとついてくるものを希釈しただけ。 気にしないでうまくいっています。 一応、SMART II Oligo、CDSプライマーの精製グレードを簡易カラムなどのゲル濾過より一段上のグレードのものを使っています。あと1st strand bufferはpowerscriptに添付されいているものを使わないで添付書類の通りのものを自作すること。bufferの滅菌はオートクレイブでなくフィルター滅菌をすること。フィルター滅菌は気休めかもしれませんが、オートクレイブ滅菌ではうまくいかなかったことがあります。 注文したプライマーなどは小分けにしておくこともおすすめします。これはあくまで自分の予想なのですがおそらく60-merくらいの長いものとなるので、悪くなりそうなイメージがあるので小分けで凍結して保存しておくといいかなと思います。 GAPDHなんかがスメアにみえていればOKです。組織によっては見えないこともありますが。 ほかになにかあればどうぞ！

RTaseのTdT活性を利用した5'-RACE法 削除/引用 No.3314-1 - 2006/11/02 (木) 15:19:31 - DSC このような内容をオープンに質問してもよいものか気になったので、わかりにくいタイトルだったかもしれませんが、、、 要は「ClontechのSMART法を自作のキットでも実施できるだろうか？」ということです。 SMART法では、RTaseが伸長したcDNAの3'末端に数個のヌクレオチド（特にdCを好んで）付加するので、その部分と3個のdGを3'末にもつ「SMART oligo」を対合させてさらに伸長させて1st strand cDNAの3'末端にアダプター配列を付加します。 今回、これを自前の試薬やプライマーでやってみようと考えています。 RTaseは念のためにキット付属のものと同じclontechのPOWER SCRIPTを使い、SMART oligoもキットの取説に公開されている配列で作ろうと思っています。 ただ、気になっているのは「もしかしてdNTP mixとかに仕掛け（dCTPだけ濃度が高いとか）があるのでは？」ということです。GATC等濃度でよいのでしょうか？ キットを用いずにSMART法を行った方はおられませんか？　何か工夫する点があればお教えください。他のRTaseでもうまくいくのかということにも興味があります。よろしくお願いいたします。

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