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Invitrogen 削除/引用 No.3169-14 - 2007/06/19 (火) 02:08:36 - D 自分もGatewayは常用しています 今となっては手放せない素晴らしい技術だと思いますが 使い始めた当初に驚いたのが InvitrogenのSequenceデータが間違いだらけだということです ｋさんのおっしゃられている配列もそれだと思います 例えばdestination vectorを作るのに必要なRfAも 最初と最後の組換え配列の部分にミスがあります (今もまだ直ってないのかな？) ちなみに当時Technicalに電話して質問をしましたが 本国に問い合わせるから2週間くれと言われたまま返事はありませんでした 始めは自分のだけこういうLotに当たったのかと思っていましたが Blastをかけるとそれで登録されているVectorのSeqが沢山ヒットしました 他にもVectorのSeqが間違っている事はInvitrogenの場合沢山あります Sequenceに関してですが推奨Primerもかかりが悪い事が多いようで 当時確かSeqが間違っているものもあったように思います 今では推奨Primerは試すこともせず使用しません モノが確かにできていて、クローニングしたものにかかり難くなる要因がないのならば、自分できちんと設計すればあっさりかかってくれるはずです エントリーベクターに極小さい配列を入れたときなどはPCRのかかりが悪くなるようですが、自分はPCR前に98℃で10〜20分と長めにボイル後、氷冷したものをすぐに使ってPCRの伸長反応を3分にすれば問題なくよめています でもこれは基本的にエントリーベクターでの話で 組換え後はSeqPCRは楽にかかるようになるという印象でした 組み換え後に一応全てSeqしてきましたが、 Seqが変化している事はありませんでした 自分の場合100%完全に組換えが起こっています 但し、1時間では反応中間体のようなものが得られる事があったので、反応時間は25℃2時間にしています 自分は古いverで、今の新しいのはよく知りませんが 組換えでDestination vectorを1 cutするのが削除されたりと変更があったようなことは聞いています 自分が試した限りでは、5kb程度なら問題ないですが 10kb以上のものは1 cutしたほうがかなり組換え効率が良くなる印象です 自分が分かるのはこのぐらいです

(無題) 削除/引用 No.3169-13 - 2007/06/18 (月) 04:46:58 - ｋ >[Re:10] Aさんは書きました : > Gatewayのexpression vector中のインサートのシークエンスを調べようとattBの外からのプライマーでPCRを行いましたが，ヘアピンが出来たのか，インサートとattB付近が抜けたものが抽出されました． 私も以前Gateway systemを使ったことがあります。　指導してくれた人は、ほぼ１００％組み替えられるはず、と言っていたのですが、2回ほど、attB付近の配列が間違っていました。　頻繁ではないと思いますが、100%ではありません。

インサートが不明 削除/引用 No.3169-12 - 2007/06/17 (日) 05:21:05 - A cDNAlibraryがインサートのGateway vectorからexpressionがpositiveなものを取ってきたものなので，インサートが不明で中からシークエンスすることが出来ないのです．

(無題) 削除/引用 No.3169-11 - 2007/06/17 (日) 01:55:09 - 銅鑼 3169-3はシークエンス時の話ではなくて，att配列付加時，エントリーベクター作製の話だと思います． att外からインサート方向のシークエンスはうまくいかないことが多かったのでインサート内にプライマーを作って読んでいました． > Gatewayのexpression vector中のインサートのシークエンスを調べようとattBの外からのプライマーでPCRを行いましたが，ヘアピンが出来たのか，インサートとattB付近が抜けたものが抽出されました．attBをプライマーにすればこれは防げるのでしょうか． > シークエンスに関して下記記述のプロトコール，あるいはそのサイトをご存知の方いませんか． > No.3169-3 - 2006/10/02 > >GATEWAYベクターは専用の反応プロトコルがあったと思いますが、試されま > >したか？最初の変性処理時間が長いだけで、他は変わりませんが。 >

Gateway 削除/引用 No.3169-10 - 2007/06/16 (土) 15:07:24 - A Gatewayのexpression vector中のインサートのシークエンスを調べようとattBの外からのプライマーでPCRを行いましたが，ヘアピンが出来たのか，インサートとattB付近が抜けたものが抽出されました．attBをプライマーにすればこれは防げるのでしょうか． シークエンスに関して下記記述のプロトコール，あるいはそのサイトをご存知の方いませんか． No.3169-3 - 2006/10/02 >GATEWAYベクターは専用の反応プロトコルがあったと思いますが、試されま >したか？最初の変性処理時間が長いだけで、他は変わりませんが。

GeneSpecificPrimer 削除/引用 No.3169-9 - 2006/10/19 (木) 13:46:04 - りょ 私もGATEWAYのDESTベクターで、Invitrogen推奨のT7プライマーを用いたシークエンス反応が失敗した経験があります。というか、毎回読めません。 インサートチェックのコロニーPCRでは使えるプライマーなんですがね。。 ただ、GeneSpecificPrimerでは綺麗に読めますので、正方向・逆方向組み合わせればインサート（＋前後200bpぐらい）はちゃんと読めてます。 結局、今までのところrecombinationで変異が入った経験はありません。

問題ありません。 削除/引用 No.3169-8 - 2006/10/07 (土) 00:41:53 - 一産婦人科医 > PCR産物をクローニングしてそれをシークエンスするなら問題ですが、PCR産物を鋳型に直接シークエンスをするなら、変異のことは問題にはなりません。 > PCR産物を直接読む場合PCR反応の初期段階に変異が起るとシークエンスに 反映される可能性があるのでは？ 誤差にしかなりませんので、シーケンスの波形には殆ど（というかまったく）影響を及ぼしません。 例えば初期の鋳型が10万個あって、そのうちの1つにPCRで変異が1サイクル目に入ったとしても、その他は問題ないわけであり、PCR終了時の変異分子の割合も10万分の1になるからです。

(無題) 削除/引用 No.3169-7 - 2006/10/06 (金) 21:49:07 - C > PCR産物をクローニングしてそれをシークエンスするなら問題ですが、PCR産物を鋳型に直接シークエンスをするなら、変異のことは問題にはなりません。 PCR産物を直接読む場合PCR反応の初期段階に変異が起るとシークエンスに 反映される可能性があるのでは？

(無題) 削除/引用 No.3169-6 - 2006/10/05 (木) 11:06:26 - 中年 > 確かにPCRで増えたものをシークエンスするということも考えたのですが、 > PCRでの変異のことを考慮して、できれば用いたくないなと考えています。 PCR産物をクローニングしてそれをシークエンスするなら問題ですが、PCR産物を鋳型に直接シークエンスをするなら、変異のことは問題にはなりません。

(無題) 削除/引用 No.3169-5 - 2006/10/04 (水) 19:48:16 - Stras 皆さんありがとうございます。なかなか反応がなかったので、少々あきらめていて見ていなかったので、一括でのレスポンスになってしまってすみません。 ＞T7とか、一般的なシークエンスプライマーが原因で配列が読めなかった ということは経験していません。サンプルの調製ミスや、GCリッチな配列を含むといったことが原因で配列が読めなかったことはあります。 ＞また、分解されやすい蛋白質の場合、特にセルライセートをアプライして いる場合はウエスタンで見えるのは分解産物だけということはよくあります。 同じcDNAを用いて他の発現ベクターも作っているのですが、そちらではシークエンスもきちんと読め、ウエスタンでも蛋白発現が確認できているので、GATEWAYシステムに起因する問題だと考えています。 ＞GATEWAYベクターは専用の反応プロトコルがあったと思いますが、試されましたか？最初の変性処理時間が長いだけで、他は変わりませんが。 シークエンスのことですね。うちではシークエンス専門の部署があって一括して行っているので、専用の反応プロトコールは用いていないと考えられます。一度相談してみます。 ＞わたしの場合はそのようなことは起こりませんでした。組み替えの効率が悪い場合はENTRYベクターを必要ないところで一ヶ所切ってLinerにしとくと良いとinvitogenの方に聞きました。あとは反応時間を延ばす（O/Nでもおっけー） PCRでのインサートチェックの結果から、組み換えはほぼ100%に近いと考えています。問題はその組み換えにおいて異常な組み換えが生じるかどうかなのです。 ＞PCRで増えた物をテンプレートにしてシークエンスを読んでみるのもダメなのでしょうか？ 確かにPCRで増えたものをシークエンスするということも考えたのですが、 PCRでの変異のことを考慮して、できれば用いたくないなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.3169-4 - 2006/10/04 (水) 18:08:30 - こぬみ GATEWAYシステムを使って結構たくさんのベクター作りをしました。 >１）recombinationでの異常はかなりの頻度で起こるものなのでしょうか？ わたしの場合はそのようなことは起こりませんでした。 組み替えの効率が悪い場合はENTRYベクターを必要ないところで一ヶ所切って Linerにしとくと良いとinvitogenの方に聞きました。 あとは反応時間を延ばす（O/Nでもおっけー） ＞２）シークエンスが読めない場合、細胞に発現させた上でウエスタンブロットなどでチェックするしか手がないのでしょうか？ DESTINATIONベクターやアデノウイルス、レンチウイルスにcDNAを移し替えして、cDNAの存在はPCRで確認できているのですが ここら辺は詳しくないのですが PCRで増えた物をテンプレートにしてシークエンスを読んでみるのもダメなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3169-3 - 2006/10/02 (月) 19:47:06 - 重吉 GATEWAYベクターは専用の反応プロトコルがあったと思いますが、試されましたか？ 最初の変性処理時間が長いだけで、他は変わりませんが。

GATEWAYは使っていませんが 削除/引用 No.3169-2 - 2006/10/02 (月) 15:43:41 - A 参考にしていただければと思います。 > １）recombinationでの異常はかなりの頻度で起こるものなのでしょうか？ 繰り返し配列や相同配列を含むベクターが大腸菌内で安定に維持されない ということを経験しています。 頻度の高低は議論できませんが、PCRで増やした以外の配列が落ちている こともあるかもしれません。 DH5αで維持されなかったベクターがStblで維持された経験もありますので、 組換えについては株を変えると解決するかもしれません。 > ２）シークエンスが読めない場合、細胞に発現させた上でウエスタンブロットなどでチェックするしか手がないのでしょうか？ T7とか、一般的なシークエンスプライマーが原因で配列が読めなかった ということは経験していません。 サンプルの調製ミスや、GCリッチな配列を含むといったことが原因で 配列が読めなかったことはあります。 GCリッチな配列を含む場合、それを読むプロトコールがあるはずですので、 試してみてはいかがでしょうか。 また、分解されやすい蛋白質の場合、特にセルライセートをアプライして いる場合はウエスタンで見えるのは分解産物だけということはよくあります。

GATEWAYシステム 削除/引用 No.3169-1 - 2006/09/30 (土) 00:11:13 - stras InvitrogenのGATEWAYシステムの使用経験のある方はいらっしゃるでしょうか？ 現在、何種類かのcDNAをサブクローニングしてGATEWAYシステムに入れて、mammalianでの発現ベクターやウイルスベクターを作成しようとしています。 ENTRYベクターをシークエンスして確かなクローンが得られています。 その後、recombination reactionを行い、DESTINATIONベクターやアデノウイルス、レンチウイルスにcDNAを移し替えして、cDNAの存在はPCRで確認できているのですが、実際に発現させてみると発現していないものがかなりあります。そこで、シークエンスで確認しようとしているのですが、 Invitrogenの推奨するprimerではシークエンスが読めなかったりして時間を食っています。 問題点は、 １）recombinationでの異常はかなりの頻度で起こるものなのでしょうか？ ２）シークエンスが読めない場合、細胞に発現させた上でウエスタンブロットなどでチェックするしか手がないのでしょうか？

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