BioTechnicalフォーラム []

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(無題)

No.3040-7 - 2006/09/11 (月) 18:40:47 - T

> 形質転換効率がrate-limiting になっているように思えるのですが。

いや、そんな事はないですよ。
例えば、選択マーカーの違う２種類のプラスミドをミックスして transform してみると分かります。形質転換効率が rate-limiting であれば、２分子入ったものはほとんど現れないはずですが、実際にはやや効率が低めになるくらいで、オーダーが変わるほどではありません。大腸菌ではあまりやりませんが、イーストではツーハイなどでごく一般的なやり方ですね。

(無題)

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No.3040-6 - 2006/09/11 (月) 17:11:55 - シュン

MMさんに質問があります。

不和合性については私もそれで納得していたのですが、よくよく考えると一つ一つの大腸菌の細胞内のプラスミドは一種類ですが、コロニーのレベルでは、まだらになるように思うのですが？

例えば、１つの大腸菌に５種類の同じ複製機構により増殖するプラスミドが最初に入ったとします。そして、分裂を繰り返し、コロニーを形成するころには、不和合性により大腸菌一個一個にはそれぞれ単一のプラスミドしか入っていないと思いますが、コロニー全体ではいろいろなプラスミドが入った大腸菌のミックスになっているように思います。

私は、プラスミドを形質転換後、シングルコロニーをとった場合に一つのプラスミドしか入っていないというのは、中年さんが言われる様に形質転換効率がrate-limiting になっているように思えるのですが。

いかがでしょうか？

私の根本的な間違いであるようにも思えるので、もし、そうでしたらお教え頂ければ幸いです。

(無題)

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No.3040-5 - 2006/09/11 (月) 00:42:58 - Bio

　わかりやすい説明ありがとうございます。参考にさせていただきます。

確率

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No.3040-4 - 2006/09/09 (土) 19:48:44 - MM

これは古典的問題で、数学セミナーの１９８０年代の増刊号に出ています。要するに数種類の同種プラスミドが入った大腸菌が生育する過程で、ちょっとした複製効率の差から数の揺らぎ・偏りが始まり、コロニーが生じるくらい分裂した後には一つのプラスミドしか見かけ上残らない、とういう結論です。

ありがとうございます

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No.3040-3 - 2006/09/08 (金) 23:53:03 - Bio

　中年さん、参考になりました。自分でも、“不和合性・・・”の部分を勉強してみます。

(無題)

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No.3040-2 - 2006/09/08 (金) 23:34:38 - 中年

必ずしも一種類のプラスミドしか入らない訳じゃないと思いますよ。この場合には、ソースとなっているDNAが少量なので、それがrate limitingになっているからでしょう。酵母からの回収に限らず、ライゲーション産物を形質転換する場合も同じ理屈ですよね。ただ、もし複数のプラスミドが入ったとしても、不和合性といって、同じ複製起点を持つプラスミドは大腸菌内に同時に維持されにくいという性質があります。

大腸菌内のプラスミドについて

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No.3040-1 - 2006/09/08 (金) 22:10:04 - Bio

　基本的な質問かもしれませんが・・・
　酵母からプラスミドを回収し、大腸菌に形質転換し、コロニーPCRをしてシーケンスの流れはお決まりのパターンですが、この過程の中で、大腸菌（DH5α）の場合、なぜ、一種類のプラスミドしか入らないのでしょうか？
　疑問に思いました。

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