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(無題) 削除/引用 No.250-10 - 2005/04/06 (水) 11:39:59 - JA >deoxycholic acidを入れる理由はなんでしょうか？？ detergentです。大抵の膜性分は溶けると思います。 2年前の記事を引っ張り出してきて、投稿者に質問を投げても返ってくる可能性はあまりないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.250-9 - 2005/04/05 (火) 20:55:28 - あかね ２年前の私の投稿ですが、 その後どうなったか返事をするのを忘れていました。 コメントを頂いた かめ様、K様、A-YAMA様、２年間も遅くなりましたが 御協力有り難うございました。 a様に対するコメントにもなるかと思いますが、 最終的には可溶化させることができました。 原因はwash後に残存する溶液が酸性だったため（TCAによる） 溶解しにくかったようです。 解決法としては, TCA沈澱後の上清、およびwashのアセトン溶液をしっかり除くことです。 酸性溶液をしっかり除いてやることで、アセトンのwashも一回ですみました。 また、それでも解けにくい場合はsample bufferにtris(pH7.0くらい）を少量加えることで溶解することができました。 いずれにせよ、原因はサンプルのpHでした。 残念ながらY様の質問の答えは知りません。 （20% TCAを等量加えるだけの為）

(無題) 削除/引用 No.250-8 - 2005/04/05 (火) 19:06:37 - a lysateをTCA沈殿するのはかなり無理があります。IP→溶出後であれば別ですが、lysateではあまりにタンパク量が多すぎて溶解できないのではないですか？

質問ですが。。。 削除/引用 No.250-7 - 2005/04/05 (火) 11:51:30 - Y A-YAMAさま deoxycholic acidを入れる理由はなんでしょうか？？ よろしくお願いいたします

re: TCA沈殿 削除/引用 No.250-6 - 2003/05/14 (水) 00:08:13 - A-YAMA いまやってプロトコール 500 ulサンプルあたり 83 ulの4% deoxycholic acidを加えて、vortexし、15 min, on ice. 167 ulの24% TCAを加えてvortex. 12k rpm 10min cent. -20oC/80% acetone洗浄 x2 (ここで、きっちりTCA洗えていないと沈殿が溶けません。vortexを頑張るか、低温室でマイクロチューブミキサーを使う) 完全に、acetoneを除く。 1x SDS sample bufferで溶かす。 (ソニケーションは必要かも。低温室でマイクロチューブミキサーを使うと楽です)

re: TCA沈殿 削除/引用 No.250-5 - 2003/05/14 (水) 00:00:16 - A-YAMA いまやってプロトコール 500 ulサンプルあたり。

no problem if I sonicate 削除/引用 No.250-4 - 2003/03/11 (火) 07:49:27 - K I am frequently doing similar procedure, and have no problem if I sonicate final samples with a tip-type sonicator. The major difference is that I only use 10% TCA without acetone. And I incubate it at room temp for 10 min, centrifuge, wash with acetone, and then wash with ether. If your buffer contains BPB, it should not be yellow.

TCA 削除/引用 No.250-2 - 2003/03/11 (火) 01:23:34 - かめくん ライゼートの溶液の組成はどんなものでしょうか。 TCAで沈澱が析出してしまう塩も存在します。 蛋白の量が多すぎるということはないですか。 よりサンプルバッファーの量を増やす。 100度煮沸ではなく、70-80度くらいで30分加熱すると解けることも あります。ただ、還元が完全にならないということもありうるので 注意が必要ですけど（ふつうは、大丈夫です）。

TCA沈殿 削除/引用 No.250-1 - 2003/03/10 (月) 19:48:18 - あかね 細胞のlysateをTCA沈殿してタンパク質を濃縮しようと思っています。 濃縮後はＳＤＳ−PAGEに用いようと思っています｡ 方法は以下のとおり １．　サンプルと等量の20%TCAinアセトンを加える ２.　 -20℃15分 ３．　1,5000rpm 15min ４．　アセトン、またはエーテルで2回洗浄 ５．　SDS-PAGE用サンプルバッファーを加える TCA沈殿してみると確かにタンパク質と思われるペレットが 確認できるのですが、サンプルバッファーに溶けません。 煮沸、ソニケーションしてもヤッパリダメです｡ 何かいい方法をご存知の方教えていただけないでしょうか？

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