今ライゲーションで困っています。幾つかのトピでライゲーションに
関する質問がされていましたが自分の場合には当てはまらない様なので
質問させてください。
インサート：あるヒトプロテアーゼ遺伝子（約1200bp）
ベクター：pQE9（大腸菌発現）、ｐPICZ（酵母発現）
インサートはPCRで増幅後TAベクターに入れてシークエンスを
確認した後２つの制限酵素（例えば大腸菌の場合EcoRIとSalI）
を用いて切り出し、ゲル抽出によって精製しています。ベクターも
制限酵素処理の後ゲル抽出してます。どちらの場合も制限酵素処理
反応がうまくいっているかどうか確認するためにコントロールと
して各一方の酵素による切断も平行して行い制限酵素が働いている
ことを確認しました。
切り出したインサート及びベクターのサイズはどちらも予想された
バンドサイズです。
ベクターやインサートはマーカーとの比較によって定量した後
モル比でベクター対インサートが5:1から1:5の間で条件を振って
ライゲーションしています。ベクターはライゲーションあたり
100ngを用いています。
ライゲーション時にはワンカットしたベクターをライゲーション
コントロールとして用いライゲースの活性に問題ないことを
確認しています。トランスフォーメーションでは少量の環状の
空ベクターを使いトランスフォーメーションに問題ないことを確認
しています。
今自分で考えられるのは
1.遺伝子の毒性により生えてこない。
2.DNAの量が少なくてラーゲーションがうまくいっていない。
ぐらいなんですが「2.」に関してはいろいろしらべてみたところ
ベクター100ngは一般的にライゲーションで使われる量のようです。
「1.」に関してはpQE9で生えてこないのはそうかもしれませんが、
酵母発現ベクターであるｐPICZにクローニングされている遺伝子が
大腸菌中で蛋白質にまで発現され毒性を示しているとは考えにくい
ように思うのですが（もちろん絶対とは言えませんが）。
どなたか何らかのアドバイス頂けませんか。宜しくお願い致します。 |
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