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Good site 削除/引用 No.2163-57 - 2007/10/07 (日) 12:30:57 - hunter <a href= ></a>

Good site 削除/引用 No.2163-56 - 2007/09/24 (月) 06:51:27 - dotarull

Good site 削除/引用 No.2163-55 - 2007/09/14 (金) 22:49:37 - hunter <a href= ></a>

(無題) 削除/引用 No.2163-28 - 2007/04/16 (月) 19:38:42 - Ｔ ＞名無しさん ＞そのタンデムアフィニティータグは最後に何かで切り取るのですか？ 　一応トロンビンで切断できるようにはしてあります。ただ、あまりよくきれないという噂ですが・・・。 ＞ 付けっぱなしでも見たい蛋白質とかの機能とか性質には影響ないのですか？ 　私も影響するのではないかと考え、最近はもっと小さなタグに変更しました。そして活性も確認できています。ただ、別の同じくらいの大きさのタンパク質では問題なく？活性が確認できているのでそれほど影響は気にしなくても良いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2163-27 - 2007/04/11 (水) 13:52:31 - 名無し そのタンデムアフィニティータグは最後に何かで切り取るのですか？（プロテアーゼ感受性配列とかみたいの入れるとかして。）付けっぱなしでも見たい蛋白質とかの機能とか性質には影響ないのですか？分子量２倍近くまで大きいリコンビナントということですが、場合のよっては別の新しい蛋白質のようにふるまって新たな高次構造とか作ってしまいそうな感じがするのですか。

変性剤 削除/引用 No.2163-18 - 2006/08/28 (月) 16:34:04 - T 変性剤を8M尿素から6Mグアニジンに変更したところ、かなり効率よく精製できるようになりました。

binding 削除/引用 No.2163-16 - 2006/05/01 (月) 22:26:53 - aq 変性条件下では、His タグ蛋白質が Ni resin に結合しにくくなっています。 そのため、私の研究室では、多めの resin (~1 mL) を用い、 30 分間、抽出液と incubation してからカラムに移しています。 (あるいは、flow-through を もう一度カラムに通す など) また、urea の濃度は、6 M です (6 M で十分だと思われます)。

(無題) 削除/引用 No.2163-15 - 2006/04/29 (土) 18:56:50 - M1のT 同じ条件で再度精製してみました。かなりキレイに精製できるのですが、多くの目的タンパク質がフロースルーのほうへいってしまいます。 もっとDTTの濃度を下げてからカラムに流してみようと考えています。

私は・・ 削除/引用 No.2163-14 - 2006/04/28 (金) 23:24:10 - M1のT 8M Ureaを含むbufferで10倍希釈して、DTTの濃度を1mMまで下げてカラムに 流しました。 多少茶色に変色してしまいましたけど。そして、フロースルーからも 目的のタンパク質が検出されましたが・・。 もう少し条件検討を行ってみたいと思います。。

(無題) 削除/引用 No.2163-13 - 2006/04/28 (金) 13:58:03 - ちなみに 後学のために質問させて頂きたいのですが、10 mM DTT処理の後は直接ニッケルカラムでしょうか。それとも透析されたのでしょうか。

遅くなりましたが・・ 削除/引用 No.2163-12 - 2006/04/27 (木) 20:56:39 - M1のT（学部四年のT） 結局タグをTrx,His,S-tagの三つのタグに変更しました。すると同じく目的タンパク質が封入体で得られました。 10mMのDTTを加えて還元を行い、変性条件下でニッケルカラム精製を行いSDS-PAGEで確認したところ、シングルバンドに近い状態で目的のタンパク質を検出することが出来ました。 皆さんからのアドバイスがあったからこその結果だと思います。 今後は頑張ってrefoldingの条件検討を行っていきたいと思います。 本当にありがとうございました。

抗体ではありませんが・・・ 削除/引用 No.2163-11 - 2006/03/16 (木) 22:13:08 - dabo 私のところでは最近はもっぱら抗体ではなくinvitrogenのinvision ingel his-tag stainを使用しています。Histag特異的な染色剤です。 さすがに抗体より感度は低いようですが、大腸菌発現系でアフィニティー精製するのなら、これで見えないくらいの発現量なら意味がないので特に問題はないと思います。 抗体を使うのに比べ、ブロッティングなどの操作をしないため作業が簡単でよいです。

daboさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.2163-10 - 2006/03/16 (木) 20:24:54 - 学部四年のT 私も以前、5mMメルカプトエタノール存在下で精製を行おうとした際に茶色に変色しました。　しかし、NiSO4をアプライした後に一度脱イオン水で洗い、その後にメルカプトエタノール入りのBufferでカラムの平衡化を行うと茶色にはならなかったのでそれほど深くは気にしていませんでした。　一度説明書をきちんと読んでから実験を行いたいと思います。　ありがとうございました。

ちなみに・・・ 削除/引用 No.2163-9 - 2006/03/16 (木) 20:14:03 - 学部四年のT 抗His-Tag抗体によるWBで確認できましたのでHis-Tagはきちんとついているようです。 私の所属する研究室ではMBLのポリクロを使用していますが、皆さんはどのメーカーのHis抗体を使用されていますか？参考にしたいのでよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2163-8 - 2006/03/16 (木) 20:13:29 - dabo Niカラムの還元剤耐性ですが、マニュアルに書かれているより弱いようです。 アマシャムでマニュアルどうり5 mMのDTTを入れると茶色くなります。 1 mM程度でもある程度茶色くなります。 一応吸着はするようですが、吸着能力は落ちていると思われます。 アマシャムの人に聞いたら、DTT濃度が5 mMだとあんまり良くないようなことを言ってました。 それなので、目安としてはDTTは0.1 mM程度に抑えておいた方がいいと思います。

皆さん、ありがとうございます。 削除/引用 No.2163-7 - 2006/03/16 (木) 20:03:36 - 学部四年のT 実験経験の少ない私にとって皆さんからの貴重な意見は大変参考になります。本当にありがとうございます。 後日結果を報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.2163-6 - 2006/03/16 (木) 14:26:48 - touseki もしDTTやメルカプトエタノールを使用するのであれば、処理後に4℃で透析すると良いかもしれません。還元されたジスルフィドは酸化剤でも与えない限り4℃では再び形成することもないでしょうし、今回は尿素も含まれているのでジスルフィド形成は不可能だと考えられます。カラムとの吸着に影響を与えうる低分子化合物をのぞくことが出来ますので良いかと思います。あとNaClですが、いちど除いて試されると良いと思います。吸着しないのが問題なのであれば、可能性は低くとも、まずは最も甘い条件で吸着することを確認されるのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2163-5 - 2006/03/16 (木) 10:07:40 - J 還元剤なしではNiカラムに吸着しないことはあります。 封入体でなくても融合蛋白を精製するときなんかに還元剤をいれると、とたんによく吸着したこともあります。 おそらくHis×6領域がマスクされているのを還元剤が解除しているのでしょう。 最近のNi樹脂は還元剤が結構使えるようになってます。 中にはダメなのもありますので確認してください。 ちなみにアマシャムが出してるのは5ｍM DTTまでいけるとあります。 また、UreaをGnHCLに変えてみるのも手です。 DTTのみでダメなときはこれもやってみてください。

還元剤は考えて使ってください 削除/引用 No.2163-4 - 2006/03/16 (木) 04:44:06 - Tagだらけですね 多くのNiカラムは還元剤まったくダメです。Amershamのはいくらか耐性のようですが… 普通はその条件ならくっつくはずですが、WBで目的タンパク質にHis-Tagがあるか確認してみてはどうでしょうか？

ありがとうございます。 削除/引用 No.2163-3 - 2006/03/15 (水) 17:09:54 - 学部四年のT 次回から還元剤を加えたいと思います。ありがとうございました。 バッファーの組成は、20mM Sodium phosphate buffer(pH7.8)、8M尿素、500mM NaClです。EDTAなどのキレート剤は加えていないのですが・・・。

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