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(無題) 削除/引用 No.20-4 - 2007/05/13 (日) 20:58:33 - 猪木 おおさんありがとうございます。 塩や界面活性剤の作用はもちろんのこと超音波破砕による可溶化についてもなるほど合点がいきました。 ＞超音波などで壊せたとしても、遠心やフィルターで除き切れない小さな断片を作っているだけで、IPするとそのスペックル断片が落ちてきて、その内容物がすべて含まれる可能せいとか考えると、かえって無理に可溶化しても何を見ているのか、、 この点が超音波で可溶化を試していたときにずっとしっくりこなかったんですよ。処理後の遠心速度や時間によっても落ちてくる度合いも違いますし、、、難しいですね。 核内分子を研究されている方はこの辺でやはり苦労されているようなので私もいろいろ条件振ってみたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.20-3 - 2007/05/12 (土) 10:12:26 - おお 溶けにくいたんぱく質に打ち当たることもしばしありますね。 >各条件で起こる可溶化って一緒なのか？ おそらく違うと思います。高塩濃度はイオン結合をきるでしょうし、界面活性剤は疎水相互作用を切る作用があります。例えば膜にうもれたたんぱく質を膜を溶解し目的のサンプルを可溶化する場合は、細胞の膜が疎水結合で維持されていますので高塩濃度よりも界面活性剤が好んで使われます。 例えば核内のスペックル状に局在するようなたんぱく質は、スペックルに存在するいろいろなタンパク(場合によっては100種類以上のたんぱく質)と共局在しているわけですが、そうなると、そこにあるたんぱく質が複雑に混ざった状態でそういう構造物を作っていると考えられますし、そのようなものを超音波などで壊せたとしても、遠心やフィルターで除き切れない小さな断片を作っているだけで、IPするとそのスペックル断片が落ちてきて、その内容物がすべて含まれる可能せいとか考えると、かえって無理に可溶化しても何を見ているのか、、、、、とか言う事態になるのではという危ぐもあります。 結局可溶化しないものは違ったアプローチの方がいいでしょうし、実際そういう状態のものを理解するうまい手法が見つかれば場合によってはノーベル賞級の研究にもなるようなきがします。 溶けない物で相互作用を見る手として、クロスリンカーを使うとか、イーストハイブリット(Y2Hは核内の特にDNAに結合するようなものはフォールスポジひらう可能性も幾らか高いような気がしますがサイトゾルで結合をみつY2Kもありますし、、、、)どを利用するとか、あとは両者のリコンビナントや変成しないまでも、結合が維持できなくなるぐらいの強い可溶化の条件で１度精製してから改めて結合をみるとか、いろいろ対策を練るしかないと思います。

蛋白が不溶性とはどんな状態？ 削除/引用 No.20-2 - 2007/05/11 (金) 18:36:04 - 猪木 ７年前のトピックを掘り出してしまいました。 核内のタンパクを生理的条件下で可溶化というところで私も同様のトラブルを抱えております。文献をたよりに界面活性剤、塩濃度、ソニケーション条件を振ってみたのですが、解決に至っておりません。最近は、前述の各条件で起こる可溶化って一緒なのか？そもそも可溶化って何だ？と混乱してきました。これらで可溶化されたタンパクは同様に扱えるものでしょうか？当方の場合塩基性タンパクではありませんがFlag-tagged proteinをHeLaに強制発現させて結合分子をIPしたとき、遠心でclearanceしてしまうとシグナルが出なかったのにclearanceなしだとシグナルが出たことがありました。なので不溶性でも反応するものがあると考えています。するとなんでclearanceなどするのだろうかと疑問に思います。可溶化の目的は、抗体との反応性を高める、ということであっていますか？また、なぜソニケーションすると可溶化するのかいまいちピンときません。 なかむらさんは解決されたのでしょうか？（もうフォローしていませんよね、きっと）

塩基性転写因子の可溶化（動物培養細胞から） 削除/引用 No.20-1 - 2000/10/23 (月) 18:16:06 - なかむら 現在２種の転写因子蛋白質を培養細胞に強制発現させて両者の結合を免疫沈降法で確認しようとしています。しかし片方の転写因子はpI:9.83というかなり塩基性の蛋白質で、界面活性剤（NP-40, TritonX100)やSonicationでlysisを試したのですが遠心分離すると（10,000g)ペレットにきてしまいます。0.6M KClを用いてlysisさせるとわずかに可溶化する程度です。しかしこの場合は高塩濃度のため2種の複合体を認めることができませんでした。核内の塩基性蛋白質をなんとか生理的条件下で可溶化させる方法はないでしょうか。

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