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(無題) 削除/引用 No.1706-13 - 2006/06/22 (木) 18:48:04 - ねるお ご返答ありがとうございます。おそらくはもともと発現量が少ないと思われます。みなさんのおっしゃられるようにもう一度スモールスケールで条件を検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1706-12 - 2006/06/22 (木) 16:16:52 - のん 皆さんはどんな順で条件を振りますか？ 1.　IPTG添加後温度 2.　IPTG濃度 3.　IPTG添加後時間 4.　IPTG添加時のOD600 他 一つずつ最適化していきますか？

(無題) 削除/引用 No.1706-11 - 2006/06/22 (木) 15:29:45 - 中年 XL1さんの仰るように、いろいろな条件を振って検討するということに尽きるのだと思いますが、ねるおさんのケースで「量がとれなかった」というのは、１）発現量がそもそも少なかったのか、２）発現はしたけれども不溶性画分に行ってしまって、上清には回収できなかった、のどちらでしょうか。それによって、振るべき条件が違ってきます。

(無題) 削除/引用 No.1706-10 - 2006/06/22 (木) 14:17:42 - XL1 私もみなさんが言う通りめんどくさいですが、スモールスケールで添加のタイミング、濃度、培養時間などなどの条件を検討するべきだと思います。 また、発現用E.coliが他にもあればそちらでも試されては？

(無題) 削除/引用 No.1706-9 - 2006/06/22 (木) 11:52:28 - ねるお 今発現しようとしているタンパクに関する文献を読むと、1mM IPTG、37℃、3時間という誘導の方法が主流なのですが、これでおこなってもあまり量がとれませんでした。そこで条件検討したいのですがみなさんが、今までIPTGによるinductionを行って、これはうまく発現できたという例を教えていただけませんか？

(無題) 削除/引用 No.1706-8 - 2005/11/19 (土) 04:51:04 - がや 私のところでは構造解析用の大量発現ですが、 通常スモールスケールで OD600= 0.4,0.6,0.8 IPTG1 mM25℃で添加後誘導行い4h,6h,8h,o/nでサンプリングし それぞれ破砕後、沈殿と可溶性画分をそれぞれ電気泳動して 一番可溶性画分が多い条件を採用してます。 これで沈殿にいくような場合は 温度をさらに下げて見たりしてます。 ＊ちなみにIPTG添加時に37℃から25℃に下げるときは、氷で適当に冷やしてから添加しています。 それぞれの条件で目的タンパク量がかなり変わりますので 大量にタンパク量が必要な場合はこのチェックをやるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1706-7 - 2005/11/18 (金) 15:21:57 - JM IPTGの添加の際ODを確認するのは増殖曲線のどのphaseに菌がいるかを見るためです。問題のない場合は、対数増殖期前期で添加するみたいな。よって添加する時はODでタイミングを計ります。回収は菌がどこの増殖相にいるかが重要なわけではなく、どれだけの時間菌にタンパクを発現させるかが重要なのでODを見る必要はないと思います。なのでここでも時間をふって最適化をおすすめします。毒性を示すタンパク質であると長くインキュベートすると逆に回収率が下がります。

ご返答ありがとうございました。 削除/引用 No.1706-6 - 2005/11/18 (金) 14:24:10 - 発言 みなさま、ご返答ありがとうございました。 誘導時期についてはわかったのですが、誘導をかけた後、どのくらいの時間培養するものなんですか？ 文献には4時間くらいと書いてあるのですが、OD値をみなくても問題ないのですか？ ご返答よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1706-5 - 2005/11/18 (金) 14:15:51 - アカハラ OD600=0.5Abs　で誘導かけたらほとんど問題ないですよ．

(無題) 削除/引用 No.1706-4 - 2005/11/17 (木) 17:37:07 - JM 私も皆様と同様にめんどくさいとは思いますが、一度は最適化をなされたほうがいいと思います。私は、まずホストの増殖曲線を作り、IPTGの濃度、添加時間を振りました。

だいたいの目安 削除/引用 No.1706-3 - 2005/11/17 (木) 14:26:20 - Brocken 濁度ＯＤ600が、0.4から0.8ぐらいで検討してみてはどうでしょうか？ 文献でもこの範囲ぐらいで紹介されていると思います。

(無題) 削除/引用 No.1706-2 - 2005/11/17 (木) 14:15:23 - ＡＪ 頻出トピの一つだと思いますが、 使う宿主、導入する遺伝子、培地、エアレーション等で最適時期は変わってくるでしょうから、普遍的な正解はないと思います。もちろん発現誘導される遺伝子によっては菌の生育に重大な影響を及ぼすこともあります。 遅すぎる、早すぎるという表現は曖昧ですが、培養開始からの時間ということでしたら、ご質問のように遅すぎるとσsのフェーズに入ってしまいますから、誘導効果は下がることが予想されますが、実際にはIPTGを入れなくても導入遺伝子がリーキーな発現をしていますので、培養時間が長くなったことで遺伝子産物の蓄積が増加しているように見えることが多いです。 要するにご質問に対する回答の主旨としては、必要ならば自分の実験系で一度はタイムコースをとって最適時期を検討してみましょう、ということです。遺伝子産物のペプチドが少量でも蓄積してればいいというような目的でしたら、たいして最適化の意味はないでしょう。

IPTG誘導のタイミング 削除/引用 No.1706-1 - 2005/11/17 (木) 11:18:27 - 発言 大腸菌BL21(DE3)で発現を行っているんですけど、IPTGで誘導を行うタイミングに迷っています。 文献で調べてみたのですが、曖昧でした。 誘導が遅すぎると目的タンパク質が発現しないと思うのですが、早すぎる場合は大丈夫なのでしょうか？ 菌体生育に影響を与えたりするのでしょうか？

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