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ＣＤ１４とＴＬＲ４のウエスタン 削除/引用 No.1685-11 - 2007/08/11 (土) 11:43:25 - 困ってる人 培養細胞をCD14とTLR4のウエスタンをやりましたが、なかなかバンドが出ません。アドバイスをお願い致します。 どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1685-10 - 2007/06/13 (水) 15:31:00 - 名無し TX100で可溶化されるのは主に外膜や核質の蛋白質だと思う。クロマチンの蛋白質やマトリクスの蛋白質はこれではほとんど抽出できない。塩濃度を上げるとクロマチンの蛋白質が抽出されるようになる。高濃度の塩溶液を使うとDNAがほどけてくるからそのときは超音波で剪断しないと扱いにくい。あとこのとき塩濃度を段階的にあげるなどして分画することもできるかもしれない。この段階でも核マトリクスはまだ溶けない。これは、最後にSDSのような変性剤いれてようやく可溶化できる。ただこれはあくまでも一般的な話で、核蛋白質といってもいろいろなので、なんでもそうだけど、ただ既存のプロトコールみて機械的にやるのでなくて、自分のみたいものがどのような性質でどこに出てくるか注意してやったほうがいいとおもう。見たい蛋白質の可溶化の特性を上手に利用すれば、抽出の段階で精製や濃縮もできる。

核内タンパク質のウエスタン 削除/引用 No.1685-9 - 2007/06/13 (水) 12:51:32 - 便乗 私も便乗させてください。 培養細胞の細胞質にあるタンパク質のウェスタンをやっているのですが。 ふと疑問に思ったことは、たとえば、 Triton-Xなどで細胞から核内タンパクを抽出する場合 抽出できるかということです。 超音波処理などで出来ると思うのですがそのような機器が ないので伺いたいのですが。

(無題) 削除/引用 No.1685-8 - 2007/06/12 (火) 20:38:09 - reference・・・ 名無しさん、 確かに4℃だとSDSが析出しそうなのですが、なんとなく室温でタンパクを長時間置いておくのが嫌でいまだに4℃で細胞のペレット＋Lysis-buffer（RIPA）＋サンプルバッファーでO/N　Cold denaturationしています。今のところ膜タンパクのWBは以前に比較してすごく上手くDetectできています。 膜蛋白質の加熱の問題について、Sodium pottasium ATPaseとboilingをキーワードにしてGoogleで検索してみたところ、いくつか論文がヒットしました。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1685-7 - 2007/06/08 (金) 14:57:27 - 名無し 4C　O/NだとSDSが析出してるかもしれない。色ついてると見えないかもしれないけどたぶんする。そうすると可溶化の力が少し落ちるとおもう。だからO/Nインキュベーションは室温の方がいいかもしれない。 膜蛋白質の加熱の問題については、Sodium pottasium ATPaseとboilingをキーワードにしてGoogleで検索してみて下さい。たぶんそれでOKとおもいます。 当たり前ですが、これは全ての場合という事ではなく、あくまで疎水性蛋白質にはそういう性質を示すものが多いということで、対象とする蛋白質ごとにケースバイケースです。その辺どうか柔軟性をもって臨んで下さい。 その先生は、論文やマニュアルどうりにやらないとダメとか言う人なのですか？たまたまそうやったら上手くいきましたけど、なんか普通にみんな知ってる事らしいですね、と答えます。私ならば。

膜たんぱく質のウエスタン 削除/引用 No.1685-6 - 2007/06/08 (金) 12:12:12 - reference・・・ こんにちは。 細胞膜に存在する185KDの膜タンパク質をWBでどうしても捕らえられなかったのですが、こちらのサイトの過去のdiscussionも含めて参考にさせていただき、上手くバンドを捕らえることが出来ました。 変更点は、今まではRIPAで細胞のペレットを溶かして95度で５分間サンプルバッファーで加熱していたものを‘疎水性の蛋白質は加熱すると凝集する‘と考え、４℃　O/Nで還元させる方法に変えたところ上手くバンドが拾えました。 さて、PIから｢どの論文を根拠に、加熱しない方法に変更したのか！｣と聞かれて自分で探してみたのですがなかなか見つけられませんでした。どなたかこの‘疎水性のタンパクを加熱しないと凝集阻止できるようになる‘ことを述べている論文をご存知でないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1685-5 - 2005/11/12 (土) 10:42:53 - おお I guess little too much tissue you use. You might not have enough SDS to denature. Keep in mind you need 1.4-1.7g SDS to denature 1g protein. Proteins account for 10-20% of tissue by weight. And you have to solubilize lipids as well as proteins by SDS. Second, you may need salt to solubilize your interested proteins. In this case you may use RIPA buffer. In addition EDTA may be effective. In another case, you need help from chaotropic reagent. Urea is popular for SDS-PAGE. I think you got preciptation by centrifugation. You may be able to exract your protein from the precipitate.

(無題) 削除/引用 No.1685-4 - 2005/11/12 (土) 09:30:55 - 名無し 思いついた事を取り合えず３点だけ。 １）ボイルしないでやってみる。 膜蛋白質など疎水性の強い蛋白質のなかにはボイルすると凝集してSDSでも溶けなくなり、ゲルに入らないことがあります。ずっと前に、ある膜輸送体蛋白質の抗体をもらった時に、上記の理由で、ボイルするとシグナルが見えなくなるので注意するようにと、書いてありました。（それでも分離ゲルのトップやスタッキングゲル、ウェルの底の位置などに僅かにブロードなシグナルがでることは時々あります。前のウエスタンブロットのデータを見てみてください）もし還元が心配なら、ｂMEの代わりに、50mM程度のDTTを使い、37Cで30-60分程度インキュベートすればよいと思います。 ２）もしも190K蛋白質が塩基性蛋白質ならば一度CAPS bufferを使ってみる。この場合はウェット式のほうがいいです。 ３）転写バッファーに最終濃度0.1-0.01%の範囲でSDS入れてみる。（メタノールの濃度を少し下げてみるのも良いかも） 190K蛋白質の性質について何か情報が提示されればレスポンスが増えるかも。

(無題) 削除/引用 No.1685-3 - 2005/11/12 (土) 08:20:54 - TOMO SDS-PAGE以降のプロトコルが追記されると思ったのですが。 (情報が断片的なので、追記すればそれだけアドバイスを受けやすいですよ) そもそも標的タンパクの発現レベルはどの程度なのですか? endogenousなものを見ようとしてるのか、多量発現系での実験なのか... 転写はウェット式ですか?セミドライ式ですか? 190kDaの巨大分子なら、ウェットかセミドライかで 劇的に転写効率が変わるかもしれません。 市販の抗体を試しているのならデータシートのリファレンスをあたって、 まずはポジコンとなる系(細胞・抽出法を含めて)を試すべきかもしれません。

チェック法 削除/引用 No.1685-2 - 2005/11/11 (金) 19:38:30 - TS > 分子量190kDaくらいのウェスタンをやっているのですが、なかなかバンドが出ません。いろいろ試して、蛋白の抽出方法、転写条件、抗体のいずれかの問題と考えています。 200KDa以上のタンパクのWBで自分がやった時にやった初歩的なチェック法 抽出がうまくいっているかチェック法 抽出し残ったペレットをサンプルバッファーに溶かしやってみる＝＞ バンドが出れば抽出が不十分。 転写が十分かチェック法 転写後のゲルとメンブレンをCBBとかで染めてみる。ゲルに残っているタンパク量から転写時間／電圧／バッファを調整。 抗体が悪い場合は、とにかくそのタンパクの標品か高発現している組織／細胞をやってみるしかないかな？ バンドが目的より低分子にないですか？Lysis　バッファーにプロテアーゼ阻害剤は、複数はいった方がいいかも。またソニケーション後の抽出条件はどうなっていますか？すぐ遠心ですか？目的のタンパクの局在はどう予想されていますか？

ウェスタン初心者 削除/引用 No.1685-1 - 2005/11/11 (金) 19:06:52 - ウェスタン初心者 分子量190kDaくらいのウェスタンをやっているのですが、なかなかバンドが出ません。いろいろ試して、蛋白の抽出方法、転写条件、抗体のいずれかの問題と考えています。 抽出方法が間違っていたのではと考えているのですが、以下の方法ではまずいのでしょうか？ 液体窒素で凍結した組織を乳鉢でホモジナイズして、100mgの組織に対して1mlのホモジナイズ溶液（2％SDS、10％メルカプトエタノール、60mmol/L Tris-HCL pH=6.8）を加えて、ソニケーションしました。これを10000rpm,10min, 4℃で遠心し上清をサンプルバッファー（0.125M Tris pH=6.8, 4%SDS, 20% グリセロール, 10% メルカプトエタノール, 0.5%BPB ）と1：1で混合し、100度、10分でボイルしました。

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