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私の場合ですが… 削除/引用 No.119-17 - 2008/02/14 (木) 21:01:01 - ナナ どうも皆様いつも参考にさせていただいております。 私の場合は、細胞膜上の局在を調べるために免疫染色を行ったことがありますが、この時細胞の固定方法により結果が異なった時がありました。一つは4％ホルムアルデヒドで固定したのと、もう一つMeOH固定を行った場合では局在が異なりました。結果から言うと両方正しい結果だったのですが、MeOH固定した時は細胞質内のタンパク局在があまりみえませんでした。膜上に存在することは確認できましたが、論文などで公表されている局在する部位に膜以外にゴルジ体付近にも局在するタンパクのはずなのに局在しないという結果が出て困った結果となりました。私の私感では、MeOH固定は4％ホルムアルデヒドより緩い状態で細胞が固定化されており、旨く細胞質内まで抗体が行き届かず染色出来なかったのではないかと考えています。 また、これとは別に細胞外マトリクスに抗体が非特異的に結合している可能性も考えられます。ムチンなど粘液分泌系の培養細胞の場合、粘液部位に非特異的に抗体が結合してしまい綺麗な結果を得られない時もあります。この場合、トリプシンなどで1分ほど処理してから細胞を免疫染色してみると綺麗な結果を得られる時もありました。

(無題) 削除/引用 No.119-11 - 2007/03/04 (日) 09:50:22 - 名無し 培養細胞の蛍光抗体法はトリッキーというか、方法がちょっと違うだけでも、細胞内局在がすごく違って見えることが時々あるように感じていました。例えば、MeOH固定かＰＦＡ固定でも結果がだいぶ違って見えることがあります。これは目的の蛋白質や抗体の特性によると思われますが、こういうときいったいどれが本当の姿なのかいつも疑問に思っています。論文みても固定法をいろいろ変えて比べているひとはあまりいないようですが、注意してみると、細胞内局在に関する結果は論文間で異なることがあります。前に組織学関係のジャーナルでproteasomeを例にあげて、固定法などを比較検討して、そういう問題点を指摘しているものがありました。だからやり方が間違っているとかではなくても、WBと蛍光抗体染色の結果が合わないことは起こりえると思います。対策としてGFPなどを発現させて生きた細胞で調べるというのがありますが、これはこれでタグが本来の正しい局在に影響を与えたるおそれはあり、外来蛋白質の過剰発現にともなう２次的な影響も危惧されるので、一長一短という感じがします。現状では異なるいくつかの方法で試してみて、総合的に結論を出すしかないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.119-9 - 2002/12/10 (火) 12:01:21 - K >それでｐHは７ぐらいになっているのですが、結合バッファーであるリン酸バッファーにバッファー交換する必要はありますか？ "普通は"ありません。 >抗原カラムを作製して抗体を精製し、同じIgG濃度を用いると精製後の力価が数倍上がりました。しかし、同じようにして組織染色を行うと精製前の抗体の方が反応が高いのです。精製後の抗体はほとんど反応しませんでした。 抗原が蛋白の場合、やばいかも。全然ちがうものをみている可能性があります。力価をどうやってはかっているのかにもよりますが。 ウエスタン、免沈などで最低限きれいな結果が得られているのなら、リコンビナントとして２つの違った領域の抗原カラムを作成し（可能ならばですが）、少なくとも２つの違った抗原認識部位をもつ抗体を精製し、チェックするのを勧めます。

抗体精製後のバッファー交換について 削除/引用 No.119-7 - 2002/12/09 (月) 15:15:38 - aku Kさん、BR-２さん質問に答えていただきありがとうございました。 またまたおかしな質問なのですが、 抗体精製時に溶出をグリシンーHCｌで行ってTris-HClで中和しています。 それでｐHは７ぐらいになっているのですが、結合バッファーであるリン酸バッファーにバッファー交換する必要はありますか？ それと今よくわからないことが起こっているので助けていただきたいのです。 抗原カラムを作製して抗体を精製し、同じIgG濃度を用いると精製後の力価が数倍上がりました。しかし、同じようにして組織染色を行うと精製前の抗体の方が反応が高いのです。精製後の抗体はほとんど反応しませんでした。 まったく意味がわからないのですが、なにかご存知の方がいらっしゃいましたら 教えてください。 また、ここを調べてみればよいという点がありましたら教えてください。 どうぞ宜しくお願いします。

免染について 削除/引用 No.119-6 - 2002/11/08 (金) 19:45:29 - BR-2 私も免染を本格的に初めて1〜2年ですが、知っている範囲内で(当たり前のことなを述べるので期待しないでください)。 ↓のKさんと同じ意見になりますが、抗体濃度については結局は自分で経験的に決定することになると思います。ただ、抗体って高価で当たり外れも多いですよね。ですから、私は文献とかカタログとか、販売業者さんとかから出来る限り情報を得て、それから実行するようにしています(抗体を買う時も)。このためボスや周りから仕事が遅いと思われたり…(苦笑) あと、若干本題から外れるかもしれませんが、免染のコツ(バックや反応性の点で)としては、｢出来るだけ薄い抗体濃度で、出来るだけ長い時間で、さらに低温(4℃)で｣というのがあります。私はこれを実践するようにしてからかなり結果が良くなったように思います。 あと免染の結果って、固定法やサンプルの状態、抗原賦活の方法でいろいろ変化して、たいへんな反面楽しかったり(奥深い?)します(笑)

自分の財布と相談して決められます。 削除/引用 No.119-5 - 2002/11/02 (土) 14:50:18 - K もし、ふつうに高価な抗体100マイクロリットルが手元にあって、すくなくとも10回はやりたければ一回の最高量は10マイクロです。わたしなら、1マイクロと0.1マイクロも一緒にやるかも。あまり細かく振る必要もありません。 >抗体濃度を濃くすれば非特異的吸着も多くなるのではないのでしょうか。 きれいな映像がえられればそれで普通はおしまいです。上記三段階で一番よい条件（ほしいシグナルがたっぷりあり、非特異的シグナルが低い条件）を選びます。それでも不満な場合は、そのときにその間の条件を検討します。 自分でとった大量の抗体の使用量に悩んでいるだとしたら、金持ちが金の使い方に悩んでいるのに似ています。

免疫染色の抗体濃度について 削除/引用 No.119-4 - 2002/10/31 (木) 23:08:59 - aku はじめまして。 私は最近免疫染色を始めた者です。 基本的なことなのですが、抗体の濃度はどうやって決定したらいいのでしょうか。 例えば、抗体濃度を濃くすれば反応がどんどんあがっていくとします。 そういう時抗体濃度をできるだけ濃くしてもいいのでしょうか。 抗体濃度を濃くすれば非特異的吸着も多くなるのではないのでしょうか。 反応の強さと非特異的吸着のバランスはどうやって調べて決めるのでしょうか。 よくわかっていないので質問がおかしいかもしれません。 すいませんが、どうぞ宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.119-3 - 2002/05/09 (木) 13:37:35 - Y もう少し初歩的なミスの可能性としては、 ウエスタンと免疫染色で抗原の状態が異なることが要因となっている可能性は どうでしょうか。 抗体によっては、可溶化されたものしか認識できない ＝ウエスタンは出るけど、組織染色では出ない、 ものがよくありますよね。 免疫組織染色でいいシグナルが取れない時に、 様々な処理をして改善されるケースもあります。

(無題) 削除/引用 No.119-2 - 2002/04/29 (月) 07:14:03 - K 目的蛋白の核局在化の話でしたら、よく起こることだと思います。ある種の多くの蛋白（DNA損傷チェックポイント関連、DNA修復関連）は核を細胞から取り出す際に漏れだしてしまいます。油断すると、細胞質に存在していると解釈してしまうくらいです。 よって、核内染色のデータのほうが、固定の操作が初期段階で行われるため、信頼の程度は比較的高くなると思います。ただし、これも、非特異的な染色と区別するため、最低２種類のちがう抗体でチェックするのが推奨されます。 かなり前に、p53のNESシグナル関連で微妙な核内外バランスを染色で追跡していた論文がEMBOにでてました。

免染　ｖｓ．　ウェスタン 削除/引用 No.119-1 - 2002/04/29 (月) 04:07:30 - 路一筋 免染の核内染色の結果とウェスタンで核タンパクを分析した結果が食い違う時には、どういう解釈をすればよいのでしょう。

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